Caco-2细胞模型研究纳米氧化锌材料的毒性和吸收转运机制

发布时间：2020-10-29 11:39

　　 目的:通过对三种纳米氧化锌的表征、探讨不同粒径纳米氧化锌对不同分化状态人结肠腺癌细胞的毒性作用并建立Caco-2细胞单层模型,阐明纳米材料对Caco-2细胞毒效应的关键影响因素及纳米氧化锌跨膜转运特征及其发生机制。方法:1.纳米氧化锌表征通过采用透射电镜和纳米粒径、电位分析仪、X射线衍射对三种不同的纳米氧化锌颗粒进行表征,检测纳米氧化锌颗粒在培养液中的溶解率。2.不同粒径纳米氧化锌对Caco-2细胞的毒性作用将Caco-2细胞接种于96孔板培养24 h(未分化细胞)或21天(分化细胞),选用三种不同尺寸的纳米氧化锌颗粒,分别为ZnO-20(25.3±5.8 nm)、ZnO-L(25.6±5.7 nm)和ZnO-100(96.7±42.7 nm),设置不同的剂量(6.25、12.5、25、50和100μg/ml)与未分化或分化的Caco-2细胞共培养24 h、48 h或72 h后,细胞活性检测(CCK-8法检测),比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率的改变以及特征性酶,碱性磷酸酶(ALP)活性改变情况。3.Caco-2细胞模型的建立及评价将Caco-2细胞浓度调整为4×10~5/ml,并接种于Transwell板小室侧内,共培养21d,在不同的培养日期(3、6、9、12、15、18、21d)测定单层细胞模型的跨膜电阻、Papp值以及模型小室侧及基底侧的碱性磷酸酶(ALP)表达改变情况,再通过透射电镜观察不同阶段细胞分化情况,综合评价Caco-2单层细胞模型是否建立成功并发展后期转运试验。4.纳米氧化锌在Caco-2细胞模型上的吸收转运及机制研究将三种纳米氧化锌的浓度设置为50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml,,每个浓度设置2个复孔,分别吸取三种纳米化锌各0.5ml加至Caco-2单层细胞模型小室侧,在不同的孵育时间从基底侧吸取培养液,采用ICP-MS法检测锌含量。设置为对照组、低温抑制组、阿米洛利组(2.5 mmol/L)、甲基β-环糊精组,低密度脂蛋白组(100μg/m L)、氯丙嗪组(10μg/m L)。在Caco-2细胞模型小室内加入上述不同的抑制剂,小室侧(BL侧)分别加入三种不同的纳米氧化锌6.25ug/ml,0.5ml,在培养不同时间从基底侧取培养液,ICP-MS法检测锌含量。结果:1.三种纳米氧化锌的粒径大小分别为25.3±5.8nm、96.7±42.7nm和25.6±5.7nm,并呈三种不同的形状。晶体结构检测提示三种纳米氧化锌均为六角纤维锌矿结构,且三种纳米氧化锌比表面积均不相同。在不同条件下的培养液中粒径分布不同,团聚状态不同,电位不同,纳米氧化锌在培养液中的溶解率为27%。2.在不同浓度条件下,三种纳米氧化锌均可抑制分化或未分化细胞活性,通过影响细胞膜结构的完整性造成LDH释放率升高,并且对碱性磷酸酶(ALP)的表达量具有抑制作用,上述作用均存在剂量反应关系。在相同浓度条件下,粒径越小毒性越大,而粒径相近时,毒性仍有差别可能与颗粒的形状等其他性质有关。同时,对于同一种纳米材料毒性作用,未分化细胞的敏感性较分化细胞强,对未分化细胞毒性作用更强。3.建立了Caco-2细胞模型。以4×10~5/ml的浓度将细胞接种与Transwell板,培养21d,细胞分化为小肠上皮细胞,呈致密连接状态,透射电镜观察可见微绒毛等结构,TEER值上升至1000Ω*cm2趋于稳定,渗透出物荧光黄在培养21天后透过率下降至16%;肠腔侧(AP侧)ALP酶活性高于基底侧(BL侧),活性比值为4.2倍。本实验各项指标均达到Caco-2单层细胞模型建立的标准。4.通过ZnO-20、ZnO-100、ZnO-L三种不同的纳米氧化锌在已建立的Caco-2单层细胞模型上的转运后结果提示,纳米氧化锌在模型上的转运过程为主动转运方式,并随着纳米氧化锌的添加浓度及时间的增加,转运量及转运率随之增加。通过添加不同的内吞途径抑制剂,研究纳米氧化锌的内吞途径,发现纳米氧化锌入胞途径具有多样性,并呈现能量依赖性。结论:1.纳米氧化锌对Caco-2细胞的毒性作用与其粒径、形状等理化性质以及细胞分化状态均相关。2.本实验条件下建立的Caco-2单层细胞模型各项验证指标满足其完整性、细胞极性、通透性的要求可用于纳米氧化锌的转运试验。3.纳米氧化锌通过主动转运方式转运,并与浓度及时间成正相关,入胞途径具有多样性,并呈现能量依赖性;
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
中英文对照表
第一部分 纳米氧化锌理化性质鉴定
    前言
    材料与方法
    结果与分析
    讨论
    本章小结
第二部分 三种纳米氧化锌对不同分化状态Caco-2细胞的毒性作用研究
    前言
    材料与方法
    结果与分析
    讨论
    本章小结
第三部分 Caco-2单层细胞模型建立及评价
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    本章小结
第四部分 纳米氧化锌在Caco-2细胞模型上的吸收机制研究
    前言
    材料与方法
    结果与分析
    讨论
    本章小结
参考文献
文献综述
    综述参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文
个人简介
开题、中期及学位论文答辩委员组成

【参考文献】

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本文编号：2860845