MC-LR诱导大鼠睾丸支持细胞凋亡的线粒体-caspase依赖性途径研究

发布时间：2017-04-08 02:01

  本文关键词：MC-LR诱导大鼠睾丸支持细胞凋亡的线粒体-caspase依赖性途径研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的通过检测细胞凋亡率、ROS含量和线粒体膜电位变化以及相关凋亡蛋白相对表达水平,探讨MC-LR是否通过线粒体介导的caspase依赖性途径诱导睾丸支持细胞凋亡,为保护、预防和治疗MC-LR所致的生殖系统损伤提供科学依据。方法1.原代细胞培养：从青春前期(日龄18-20天)SD大鼠睾丸中提取、分离、纯化睾丸支持细胞,建立原代培养睾丸支持细胞模型。2.CCK-8实验：CCK-8试剂盒检测不同浓度MC-LR (0,1,5,10,20,40, 60 p.g/ml)作用睾丸支持细胞24h后细胞增殖变化,确定ICso,设置ICso/4、IC50/2、IC50为后续实验浓度。3.实验分组：睾丸支持细胞分为对照组(培养液)、ICso/4、IC50/2、IC50 MC-LR组和Caspase抑制剂zVADfink (50pmol/L)+IC50MC-LR组以及抗氧化剂NAC(10mmol/L)+IC50MC-LR组,继续培养24h。4.凋亡率检测：AnnexinV-FITC/PI双染联合流式细胞仪检测各处理组细胞凋亡率变化。5.活性氧检测：ROS试剂盒联合荧光显微镜和流式细胞仪检测不同浓度MC-LR和NAC预处理组细胞内ROS荧光值变化。6.线粒体膜电位：JC-1试剂盒联合流式细胞仪检测不同浓度MC-LR和NAC预处理组细胞线粒体膜电位变化。7.蛋白检测：利用Western Blot法检测各处理组细胞内细胞色素C、Caspase-9、Cleaved-Caspase-9以及Caspase-3蛋白相对表达量变化。结果1.不同浓度MC-LR (0,1,5,10,20,40,60μg/ml)作用睾丸支持细胞24h后,细胞增殖被明显抑制,且随着MC-LR浓度升高,增殖抑制率显著升高(P0.05)。经计算MC-LR作用睾丸支持细胞24h ICso为32μg/ml,后续实验浓度分别为：8μg/ml,16μg/ml和32μg/ml。2. MC-LR能诱导睾丸支持细胞凋亡,8μg/ml,16μg/ml和32μg/ml染毒组细胞凋亡率分别为3.9000%±0.200%、6.000%±0.100%、27.266%±0.115%,随着MC-LR浓度升高,细胞凋亡率显著升高(P0.05)。3. MC-LR能增加睾丸支持细胞内ROS含量。荧光显微镜和流式结果均显示：随着MC-LR浓度升高,荧光值明显升高,细胞内ROS含量显著增加(P0.05)。4. MC-LR能降低睾丸支持细胞线粒体膜电位,且随着MC-LR浓度升高,线粒体膜电位显著降低(P0.05)。5. MC-LR能增加睾丸支持细胞Cyt-c、Caspase-9、Cleaved-Caspase-9以及Caspase-3的相对表达量,且随着MC-LR浓度升高,四种蛋白相对表达量显著升高(P0.05)。6. Caspase抑制剂zVADfmk预处理可使32μg/ml MC-LR组细胞凋亡率由27.266%±0.115%下降至9.633±00.057%(P0.05),且能显著降低四种蛋白的相对表达量(P0.05)。7.抗氧化剂NAC预处理可使32μg/ml MC-LR组细胞凋亡率由27.266±0.115%下降至13.200%±0.100%(P0.05),且明显降低细胞内ROS含量、抑制线粒体膜电位降低以及降低四种蛋白的相对表达量(P0.05)。结论1.微囊藻毒素-LR在一定浓度范围内可明显抑制睾丸支持细胞的增殖,并诱导其凋亡。2.线粒体介导的caspase依赖性途径可能是微囊藻毒素-LR诱导睾丸支持细胞凋亡的主要途径之一。3.活性氧参与了微囊藻毒素-LR诱导睾丸支持细胞凋亡过程。
【关键词】：微囊藻毒素-LR 睾丸支持细胞 活性氧 线粒体-Caspase 依赖性 凋亡
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 缩略词表12-13
• 1 前言13-16
• 2 材料与方法16-27
• 2.1 原代培养大鼠睾丸支持细胞的动物来源16
• 2.2 实验仪器及试剂16-18
• 2.3 主要试剂配制18-19
• 2.4 实验方法19-26
• 2.4.1 睾丸支持细胞的分离以及培养19-20
• 2.4.2 MC-LR对睾丸支持细胞增殖抑制的测定20
• 2.4.3 睾丸支持细胞线粒体膜电位(MMP)的测定20-21
• 2.4.4 睾丸支持细胞中活性氧ROS的测定21-22
• 2.4.5 睾丸支持细胞凋亡率的测定22-23
• 2.4.6 睾丸支持细胞凋亡相关蛋白分子的测定23-26
• 2.5 统计分析方法26-27
• 3 实验结果27-42
• 3.1 不同浓度MC-LR对睾丸支持细胞增殖的影响27-28
• 3.2 不同浓度MC-LR对睾丸支持细胞凋亡率的影响28-30
• 3.3 不同浓度MC-LR对睾丸支持细胞内ROS含量的影响30-32
• 3.4 不同浓度MC-LR对睾丸支持细胞线粒体膜电位的影响32-33
• 3.5 不同浓度MC-LR对睾丸支持细胞中线粒体caspase依赖性途径相关蛋白表达的影响33-34
• 3.6 Caspase抑制剂zVADfmk预处理对睾丸支持细胞凋亡率的影响34-36
• 3.7 Caspase抑制剂zVADfmk预处理对睾丸支持细胞相关凋亡蛋白表达的影响36-37
• 3.8 抗氧化剂NAC预处理对睾丸支持细胞凋亡率的影响37-38
• 3.9 抗氧化剂NAC预处理对睾丸支持细胞ROS含量的影响38-39
• 3.10 抗氧化剂NAC预处理对睾丸支持细胞线粒体膜电位的影响39-40
• 3.11 抗氧化剂NAC预处理对睾丸支持细胞凋亡相关蛋白表达的影响40-42
• 4 讨论42-47
• 4.1 MC-LR抑制睾丸支持细胞增殖并诱导其凋亡42-43
• 4.2 ROS在MC-LR诱导睾丸支持细胞凋亡中的调控作用43-44
• 4.3 线粒体在MC-LR在诱导睾丸支持细胞凋亡中的重要作用44-45
• 4.4 MC-LR对睾丸支持细胞线粒体caspase依赖性凋亡途径相关蛋白表达的影响45-47
• 5 结论47-48
• 参考文献48-53
• 综述53-73
• 参考文献65-73
• 个人简历73-74
• 致谢74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 杨黎江;沈放;仝向荣;路斌;高四爱;马银海;;重楼皂苷对微囊藻毒素致小鼠肾损伤保护作用的组织学研究[J];昆明学院学报;2013年06期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 孙瑜;微囊藻毒素LR对肝细胞系HL7702内的蛋白磷酸酶PP2A下游靶点的影响[D];浙江大学;2012年

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本文编号：291800