卤代醌类化合物介导肝细胞炎症反应、内质网应激和凋亡的信号通路分析

发布时间：2017-04-08 03:06

  本文关键词：卤代醌类化合物介导肝细胞炎症反应、内质网应激和凋亡的信号通路分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：卤代醌类化合物是环境中广泛存在的一类持久有机污染物,它们主要由多卤代芳香族化合物通过化学反应、酶促反应以及生物体内代谢等多种途径脱卤形成,在以上过程中形成了大量中间产物,这些中间产物多具有细胞毒性、遗传毒性、神经毒性、免疫毒性等多种毒性效应,严重威胁着人类健康。本课题分为两个部分,从体内和体外水平揭示卤代醌类化合物的毒性机制,为完善卤代醌类化合物毒性机制提供新的内容,为卤代醌类化合物引起疾病的预防和治疗提供新的思路。第一部分：姜黄素拮抗四氯苯醌诱导小鼠肝损伤的机制研究四氯苯醌(TCBQ)由广泛应用的木材防腐剂五氯酚(PCP)代谢产生,代谢过程发生氧化还原反应,并由此产生大量的活性氧(ROS),从而造成机体氧化损伤。肝脏是人体主要的代谢与解毒器官,TCBQ在体内代谢可能会造成肝脏损伤。姜黄素(Curcumin)是从姜黄根茎中提取的一种天然多酚产物,具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗凝、降血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理作用。它抗氧化与清除自由基的作用能够保护机体免受氧化应激的损伤。同时,在本实验中我们研究了姜黄素拮抗四氯苯醌诱导小鼠急性肝损伤的作用机制。本实验利用四氯苯醌(TCBQ)建立小鼠急性肝损伤模型,我们把32只昆明小鼠随机分为四组,每组8只：对照组、姜黄素组、TCBQ组和TCBQ+姜黄素组。对照组小鼠给予等量的溶剂,姜黄素组小鼠连续5天给予姜黄素,TCBQ组小鼠给予单剂量的TCBQ, TCBQ+姜黄素组小鼠连续5天腹腔注射给予姜黄素,在最后一次给予姜黄素3小时后腹腔注射给予TCBQ,24小时后取小鼠血清及肝脏检测肝脏损伤相关指标。我们在血清中检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,在肝脏中检测TBARS、SOD、CAT水平。这些结果显示四氯苯醌对小鼠肝脏造成了严重的损伤。HE染色观察肝脏病理学变化,结果显示TCBQ组中有大量的炎症细胞浸润,说明在这肝脏中存在炎症反应。iNOS、COX-2免疫组化和p65、TNF-α、IL-6、IL-β、IκB、P-IκB Western blot结果进一步证明了四氯苯醌诱导的肝损伤主要为炎症反应。我们进一步考察了凋亡相关蛋白Bax、 Bc1-2、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的表达,发现TCBQ组中这些蛋白的表达与其它组相比没有明显变化。Cleaved Caspase 3免疫组化结果也无明显变化。这表明四氯苯醌不引起肝细胞凋亡有研究表明,姜黄素的保护作用归因于它清除自由基的能力,因此,我们选取重要的抗氧化信号通路Nrf2/Keap1/ARE作为研究对象。实验结果显示姜黄素激活了Nrf2/Keap1/ARE信号通路,对四氯苯醌诱导的急性肝损伤发挥了较好的拮抗作用。以上研究表明四氯苯醌诱导的急性肝损伤主要为炎症反应,但不引起肝细胞凋亡。姜黄素通过激活Nrf2/Keap1/ARE信号通路,调节Ⅱ相代谢酶HO-1、NQO1在肝组织的表达,从而达到保护肝脏的作用。第二部分：多氯联苯醌通过内质网应激途径诱导HepG2田胞凋亡的机制分析多氯联苯醌(PCBQ)是氯代芳香族化合物多氯联苯(PCBs)的主要代谢产物。近年有研究报道,PCBs代谢产物可以诱导机体产生氧化应激反应,进而造成氧化损伤。而氧化应激反应、内质网应激反应和凋亡有密切联系,这就提示我们多氯联苯醌可能引起内质网应激反应及凋亡。本实验选用人肝癌HepG2细胞作为研究对象,以考察多氯联苯醌是否能够在HepG2细胞中诱导内质网应激反应及凋亡的发生。首先,在荧光显微镜和透射电镜下观察HepG2细胞及其内质网在未加PCB29-pQ与加入10 μM PCB29-pQ处理48 h后的形态变化,结果发现在给药组细胞中出现了凋亡及内质网应激的典型特征。然后从浓度梯度和时间梯度上分别考察PCB29-pQ诱导内质网应激相关蛋白的表达情况,并用RT-PCR分析基因Bip、GRP94、XBP-1的mRNA表达水平。与对照组相比,PCB29-pQ处理的细胞相应蛋白和基因的表达量均有明显提高。用流式细胞仪检测PCB29-pQ引起细胞内钙水平的变化。实验结果表明PCB29-pQ能够提高细胞内钙水平。这些结果说明了PCB29-pQ能够诱导HepG2细胞发生内质网应激。在形态学考察中发现PCB29-pQ处理的细胞有明显的凋亡现象,因此,我们根据文献报道选取了内质网应激反应中三条参与凋亡调控的信号通路：PERK/eIF2α/ATF4/CHOP、Caspase 12/Caspase 9/Caspase 3和IRE1α/JNK/c-Jun进行研究。一系列实验结果证明,PCB29-pQ通过激活PERK/eIF2a/ATF4/CHOP、Caspase 12/Caspase 9/Caspase 3信号通路诱导HepG2细胞凋亡。接着用加入钙离子螯合剂BAPTA-AM和ROS清除剂NAC的方法以考察PCB29-pQ引起内质网应激的原因。结果表明,PCB29-pQ引起的内质网应激受细胞内钙离子和ROS水平的调节。根据以上研究可知,PCB29-pQ能够诱导HepG2细胞发生内质网应激,并受细胞内钙离子浓度和ROS水平的调节。PCB29-pQ引起的凋亡受PERK/eIF2a/ATF4/CHOP和Caspase 12/Caspase 9/Caspase 3信号通路的调控,而IRE1α/JNK/c-Jun通路在本实验中没有被激活,未参与PCB29-pQ引起的细胞凋亡。
【关键词】：四氯苯醌 多氯联苯醌 氧化应激 内质网应激 凋亡
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 缩写符号对照表14-15
• 第一章 绪论15-21
• 1.1 持久有机污染物的定义及特点15
• 1.2 持久有机污染物的分类及来源15-16
• 1.3 持久有机污染物的危害16-18
• 1.3.1 六氯苯的毒性16
• 1.3.2 多氯联苯的毒性16-18
• 1.4 国外POPs研究概况18
• 1.5 我国现状18-19
• 1.6 立题意义19-21
• 第二章 姜黄素拮抗四氯苯醌诱导小鼠肝损伤机制研究21-35
• 2.1 前言21-22
• 2.1.1 活性氧类(ROS)21-22
• 2.1.2 姜黄素及其抗氧化作用机制22
• 2.1.3 本课题研究目的22
• 2.2 实验材料22-24
• 2.2.1 试剂22-23
• 2.2.2 动物23
• 2.2.3 主要仪器设备23
• 2.2.4 常用试剂制备方法23-24
• 2.3 实验方法24-27
• 2.3.1 实验模型的建立24
• 2.3.2 检测血清中ALT、AST活性24
• 2.3.3 组织病理学检查24-25
• 2.3.4 检测脂质过氧化物和抗氧化酶25
• 2.3.5 iNOS活性测定25
• 2.3.6 免疫组化染色25-26
• 2.3.7 核提取物的制备26
• 2.3.8 全蛋白提取物的制备26
• 2.3.9 Western-blot检测26-27
• 2.3.10 数据分析27
• 2.4 实验结果与讨论27-35
• 2.4.1 TCBQ和姜黄素对血清中AST、ALT水平的影响27
• 2.4.2 TCBQ和姜黄素对组织病理损伤的影响27-28
• 2.4.3 TCBQ和姜黄素对TBARS形成的影响28-29
• 2.4.4 TCBQ和姜黄素对肝抗氧化物酶活性的影响29
• 2.4.5 TCBQ和姜黄素对COX-2和iNOS表达的影响29-30
• 2.4.6 TCBQ和姜黄素对NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β表达的影响30-31
• 2.4.7 TCBQ和姜黄素对Caspase 3、Caspase 8、Caspase 12、Bcl-2、Bax表达的影响31-32
• 2.4.8 TCBQ和姜黄素对Nrf2信号通路的激活和HO-1/NQO1表达的影响32-33
• 2.4.9 讨论33-35
• 第三章 多氯联苯醌通过内质网应激途径诱导HepG2细胞凋亡的机制分析35-53
• 3.1 前言35-37
• 3.1.1 未折叠蛋白反应(UPR)35-36
• 3.1.2 Caspase 1236
• 3.1.3 钙蛋白酶36
• 3.1.4 钙离子(Ca~(2+))36-37
• 3.1.5 本课题提出背景及研究目的37
• 3.2 实验材料37-38
• 3.2.1 试剂37-38
• 3.2.2 细胞38
• 3.2.3 主要仪器设备38
• 3.3 实验方法38-41
• 3.3.1 细胞培养38
• 3.3.2 实验分组38-39
• 3.3.3 透射电镜观察细胞超微结构39
• 3.3.4 流式细胞仪检测凋亡39
• 3.3.5 细胞内ROS检测39
• 3.3.6 细胞内钙离子浓度检测39-40
• 3.3.7 钙蛋白酶活性分析40
• 3.3.8 细胞全蛋白提取物制备40
• 3.3.9 Western-blot检测40
• 3.3.10 实时荧光定量PCR分析40-41
• 3.3.11 数据分析41
• 3.4 实验结果与讨论41-53
• 3.4.1 PCB29-pQ诱导HepG2细胞凋亡41-42
• 3.4.2 PCB29-pQ诱导HepG2细胞发生内质网应激反应42-44
• 3.4.3 PCB29-pQ激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路诱导HepG2细胞凋亡44-45
• 3.4.4 PCB29-pQ激活Caspase12/Caspase 9/Caspase 3通路诱导HepG2细胞凋亡45-46
• 3.4.5 PCB29-pQ对IRE1α/XBP-1通路的影响46-47
• 3.4.6 PCB29-pQ对细胞内钙离子水平和钙蛋白酶活性的影响47-48
• 3.4.7 考察ROS水平对PCB29-pQ诱导内质网应激的影响48-50
• 3.4.8 讨论50-53
• 参考文献53-61
• 致谢61-63
• 科研成果63

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本文编号：291916