耳蜗外毛细胞Prestin过表达病毒载体的构建与应用研究
发布时间：2022-01-09 13:55
噪声性听力损失（noise-induced hearing loss,NIHL）是由于长期暴露在噪声环境中所引起的感音性耳聋,是最常见的职业病之一,NIHL目前尚无有效的治疗方法,根本原因在于耳蜗外毛细胞（Outer hair cells,OHCs）受到噪声的损害发生不可逆性死亡,Prestin蛋白是耳蜗OHCs特有的重要感音功能蛋白,是OHCs电运动以及耳蜗放大效应的分子基础,并在OHCs损伤时呈代偿性升高弥补听力损失。目的通过构建耳蜗毛细胞重组Prestin腺相关病毒-2（AAV-2）载体,为耳蜗Prestin蛋白调控研究提供工具,同时构建一种新型无创的内耳基因转染系统。方法以豚鼠Prestin基因为模板,PCR扩增与提取,利用基因工程技术构建AAV-2-Prestin载体,转染培养的耳蜗毛细胞（HEI-OC1细胞株）后1d、3d、5d采用Western blot检测Prestin的表达水平。将构建好的重组Prestin腺相关病毒2型载体,与原位凝胶混合后经鼓膜穿刺鼓室给药的圆窗途径转染豚鼠内耳,免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布,耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和Prest...
【文章来源】：广东药科大学广东省
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pAAV-EGFP-Prestin载体图谱
广东药科大学硕士研究生学位论文113结果3.1pAAV-Prestin原病毒质粒验证为验证pAAV-Prestin原病毒质粒是否构建成功，观察原病毒质粒转染HEK-293T工具细胞，在一定的时间内，HEK-293T细胞出现绿色荧光蛋白表达说明构建成功。pAAV-Prestin原病毒质粒转染HEK-293T细胞后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，第1d可见微弱荧光表达，第3d可见荧光表达达到高峰，第5d荧光表达较第3d强度稍有减弱（图3.1）。图3.1不同转染时间绿色荧光蛋白表达比较3.2AAV-2-Prestin转染HEI-OC1细胞Prestin表达结果荧光显微镜下原病毒质粒转染工具细胞，出现绿色荧光蛋白表达，说明原病毒质粒构建成功，采用AAV-2包装原病毒质粒，为验证包装后重组病毒载体具有对体外培养毛细胞的靶向性，使用AAV-2-Prestin转染HEI-OC1细胞，WB检测转染后不同时间内Prestin蛋白表达情况。AAV-2-Prestin转染HEI-OC1细胞，各组Prestin蛋白表达水平采用多组均数比较的方差分析，结果见表3.1、图3.2.1和图3.2.2，与对照组相比，不同转染时间的各组Prestin蛋白表达水平显著增高（F=414.755，P＜0.001），3d和5d组
广东药科大学硕士研究生学位论文12Prestin蛋白表达水平显著高于1d（P＜0.001），3d组Prestin蛋白表达显著高于5d组（P＜0.001）。表3.1各组Prestin表达水平比较（±s）组别样品数Prestin(相对灰度值)空白组60.045±0.0021d60.052±0.0013d60.076±0.0025d60.061±0.002F414.755P＜0.001图3.2.1Western-blot检测各组HEI-OC1细胞中Prestin表达图3.2.2各组HEI-OC1细胞中Prestin蛋白的表达水平（WB检测）注：a表示control组与1d、3d、5d的Prestin蛋白相对表达量有统计学差异（P﹤0.05）；b表示1d组与3d、5d的Prestin蛋白相对表达量有统计学差异（P﹤0.05）；c表示3d组与5d组的Prestin蛋白相对表达量有统计学差异（P﹤0.05）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]温敏型原位凝胶剂在抗癌领域的研究与应用[J]. 史健艺,朱鹤云,朴慧顺,冯波. 吉林医药学院学报. 2019(05)
[2]pH敏感型氯霉素眼用原位凝胶的制备及释放度考察[J]. 赵玉娜,郝秀娟. 西北药学杂志. 2018(06)
[3]原位凝胶剂的研究现状与应用前景[J]. 丛志新,樊慧敏,吴春芝,谷福根. 中南药学. 2018(09)
[4]年龄相关听力损失DBA/2J小鼠耳蜗毛细胞马达蛋白-prestin表达下调与耳聋的关系[J]. 李胜利,武坤毅,任晓勇. 中华耳科学杂志. 2018(04)
[5]内耳药物递送的研究进展[J]. 袁芳,亓卫东. 中华耳科学杂志. 2018(04)
[6]原位凝胶在中药靶向制剂中的研究进展[J]. 敖惠,柏佳倩,张玉婷,高淑颖,刘威岑,党云洁. 中国药师. 2017(07)
[7]平阳霉素壳聚糖温敏原位凝胶的制备及体外评价[J]. 陈奋,贾连群,秦兴军,潘卫三. 中国医院药学杂志. 2017(09)
[8]鸦胆子油鼻用pH敏感型原位凝胶制备及体外释放行为研究[J]. 宋逍,段玺,唐志书,王昌利,赵鹏,权颜. 辽宁中医药大学学报. 2016(10)
[9]噪声性听力损失与耳蜗外毛细胞Prestin蛋白的相关性分析[J]. 陈秉,夏源,王海涛,杨翠婵,王军义. 中国工业医学杂志. 2015(02)
[10]噪声性听力损伤对豚鼠耳蜗Prestin蛋白及mRNA表达水平影响[J]. 王军义,邹志辉,陈晓滨,张敏,杨翠婵,夏源. 中国职业医学. 2014(04)
硕士论文
[1]离子敏感型阿奇霉素眼用凝胶的制备及体外释放研究[D]. 王聪莉.郑州大学 2019
[2]IL-10基因重组慢病毒载体不同途径导入内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究[D]. 陈文博.南京医科大学 2010
本文编号：3578848
【文章来源】：广东药科大学广东省
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pAAV-EGFP-Prestin载体图谱
广东药科大学硕士研究生学位论文113结果3.1pAAV-Prestin原病毒质粒验证为验证pAAV-Prestin原病毒质粒是否构建成功，观察原病毒质粒转染HEK-293T工具细胞，在一定的时间内，HEK-293T细胞出现绿色荧光蛋白表达说明构建成功。pAAV-Prestin原病毒质粒转染HEK-293T细胞后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，第1d可见微弱荧光表达，第3d可见荧光表达达到高峰，第5d荧光表达较第3d强度稍有减弱（图3.1）。图3.1不同转染时间绿色荧光蛋白表达比较3.2AAV-2-Prestin转染HEI-OC1细胞Prestin表达结果荧光显微镜下原病毒质粒转染工具细胞，出现绿色荧光蛋白表达，说明原病毒质粒构建成功，采用AAV-2包装原病毒质粒，为验证包装后重组病毒载体具有对体外培养毛细胞的靶向性，使用AAV-2-Prestin转染HEI-OC1细胞，WB检测转染后不同时间内Prestin蛋白表达情况。AAV-2-Prestin转染HEI-OC1细胞，各组Prestin蛋白表达水平采用多组均数比较的方差分析，结果见表3.1、图3.2.1和图3.2.2，与对照组相比，不同转染时间的各组Prestin蛋白表达水平显著增高（F=414.755，P＜0.001），3d和5d组
广东药科大学硕士研究生学位论文12Prestin蛋白表达水平显著高于1d（P＜0.001），3d组Prestin蛋白表达显著高于5d组（P＜0.001）。表3.1各组Prestin表达水平比较（±s）组别样品数Prestin(相对灰度值)空白组60.045±0.0021d60.052±0.0013d60.076±0.0025d60.061±0.002F414.755P＜0.001图3.2.1Western-blot检测各组HEI-OC1细胞中Prestin表达图3.2.2各组HEI-OC1细胞中Prestin蛋白的表达水平（WB检测）注：a表示control组与1d、3d、5d的Prestin蛋白相对表达量有统计学差异（P﹤0.05）；b表示1d组与3d、5d的Prestin蛋白相对表达量有统计学差异（P﹤0.05）；c表示3d组与5d组的Prestin蛋白相对表达量有统计学差异（P﹤0.05）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]温敏型原位凝胶剂在抗癌领域的研究与应用[J]. 史健艺,朱鹤云,朴慧顺,冯波. 吉林医药学院学报. 2019(05)
[2]pH敏感型氯霉素眼用原位凝胶的制备及释放度考察[J]. 赵玉娜,郝秀娟. 西北药学杂志. 2018(06)
[3]原位凝胶剂的研究现状与应用前景[J]. 丛志新,樊慧敏,吴春芝,谷福根. 中南药学. 2018(09)
[4]年龄相关听力损失DBA/2J小鼠耳蜗毛细胞马达蛋白-prestin表达下调与耳聋的关系[J]. 李胜利,武坤毅,任晓勇. 中华耳科学杂志. 2018(04)
[5]内耳药物递送的研究进展[J]. 袁芳,亓卫东. 中华耳科学杂志. 2018(04)
[6]原位凝胶在中药靶向制剂中的研究进展[J]. 敖惠,柏佳倩,张玉婷,高淑颖,刘威岑,党云洁. 中国药师. 2017(07)
[7]平阳霉素壳聚糖温敏原位凝胶的制备及体外评价[J]. 陈奋,贾连群,秦兴军,潘卫三. 中国医院药学杂志. 2017(09)
[8]鸦胆子油鼻用pH敏感型原位凝胶制备及体外释放行为研究[J]. 宋逍,段玺,唐志书,王昌利,赵鹏,权颜. 辽宁中医药大学学报. 2016(10)
[9]噪声性听力损失与耳蜗外毛细胞Prestin蛋白的相关性分析[J]. 陈秉,夏源,王海涛,杨翠婵,王军义. 中国工业医学杂志. 2015(02)
[10]噪声性听力损伤对豚鼠耳蜗Prestin蛋白及mRNA表达水平影响[J]. 王军义,邹志辉,陈晓滨,张敏,杨翠婵,夏源. 中国职业医学. 2014(04)
硕士论文
[1]离子敏感型阿奇霉素眼用凝胶的制备及体外释放研究[D]. 王聪莉.郑州大学 2019
[2]IL-10基因重组慢病毒载体不同途径导入内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究[D]. 陈文博.南京医科大学 2010
本文编号：3578848
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