锰诱导的α-synuclein蛋白寡聚体与自噬的相互作用对神经细胞损伤的分子机制研究

发布时间：2022-10-08 16:33

　　目的:锰（Manganese,Mn）作为人体必需微量元素之一,参与体内多种重要激酶的构成和生物反应,对维持中枢神经系统的正常功能十分重要。然而,长期慢性的Mn暴露可以引发神经系统损伤,神经行为发生异常改变,表现为类帕金森样综合征,即锰中毒。由于锰在工业生产中的广泛使用,职业性Mn暴露已成为引发神经退行性疾病的重要环境致病因素。关于Mn引起的神经毒作用机制研究有很多,包括线粒体损伤,内质网应激,氧化应激损伤,α-突触核蛋白（Alpha-synuclein,α-Syn）寡聚化,自噬功能异常等等。自噬作为机体的降解/再循环系统,参与维持体内蛋白质稳态,调节凋亡。目前有研究发现自噬功能异常与神经退行性变密切相关,因此,在锰诱导的神经毒性过程中,其诱导的α-Syn寡聚化与自噬功能异常之间存在着非常复杂的关系,亟待研究。自噬作为机体的保护性机制,受多种信号通路调节,如mTOR-ULK和Beclin1-PIK3C3。mTOR（Mammalian target of rapamycin）信号通路的抑制与自噬活化有关。Beclin1可以与胞浆内的高迁移率族蛋白1（High-mobility group ... 

【文章页数】：148 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分:α-Syn蛋白对锰诱导小鼠神经细胞自噬的影响
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 研究对象和分组
        2.3 测定指标及方法
            2.3.1 基因型鉴定
            2.3.2 神经行为学测试
            2.3.3 纹状体锰含量测定
            2.3.4 脑内Lamp2A、HSC70和α-Syn mRNA相对表达水平检测
            2.3.5 检测纹状体内Lamp2A、HSC70、Beclin1、LC3B、p62和α-Syn蛋白寡聚体的表达水平
            2.3.6 检测纹状体细胞凋亡和自噬发生水平
            2.3.7 激光共聚焦观察Lamp2A与 HSC70、α-Syn蛋白共定位情况
            2.3.8 免疫共沉淀技术分析Lamp2A与 HSC70、α-Syn蛋白间的相互作用
            2.3.9 透射电镜观察自噬体的形成
        2.4 统计分析
    3 结果
        3.1 锰暴露引起α-Syn~(+/+)和α-Syn~(-/-)小鼠的异常行为学改变
            3.1.1 Open field实验结果
            3.1.2 强迫游泳、爪抓力以及双足平衡实验结果
        3.2 α-Syn对脑锰含量及神经细胞损伤的影响
            3.2.1 纹状体锰含量情况
            3.2.2 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠神经细胞凋亡的影响
        3.3 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠神经细胞自噬的影响
        3.4 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠自噬CMA途径的影响
            3.4.1 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠Lamp2A和 HSC70 mRNA及蛋白表达的影响
            3.4.2 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠Lamp2A和 HSC70共定位以及相互作用的影响
            3.4.3 CMA途径可能参与锰诱导的α-Syn过表达的降解
        3.5 锰暴露对α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠巨自噬的影响
    4 讨论
    5 结论
第二部分:自噬对锰诱导小鼠神经细胞α-Syn蛋白寡聚化的影响
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 研究对象和分组
        2.3 测定指标及方法
            2.3.1 神经行为学测试
            2.3.2 纹状体锰含量测定
            2.3.3 检测纹状体细胞凋亡和自噬发生水平
            2.3.4 纹状体α-Syn mRNA相对表达水平检测
            2.3.5 检测纹状体内Beclin1、LC3B、p62和α-Syn蛋白寡聚体的表达水平
        2.4 统计分析
    3 结果
        3.1 锰暴露对小鼠神经行为的影响
            3.1.1 Open field实验结果
            3.1.2 强迫游泳、爪抓力以及双足平衡实验结果
        3.2 Rap和3-MA对锰神经毒性的影响
            3.2.1 Rap和3-MA对纹状体锰含量的影响
            3.2.2 Rap和3-MA对锰诱导神经细胞凋亡的影响
        3.3 Rap和3-MA对锰诱导自噬的影响
            3.3.1 Rap和3-MA对锰诱导自噬水平的影响
            3.3.2 Rap和3-MA对锰诱导自噬相关蛋白表达的影响
        3.4 Rap和3-MA对锰诱导α-Syn寡聚化的影响
            3.4.1 Rap和3-MA对锰诱导α-Syn mRNA转录水平的影响
            3.4.2 Rap和3-MA对锰诱导α-Syn蛋白表达水平的影响
    4 讨论
    5 结论
第三部分:柯诺辛碱B缓解锰诱导的α-Syn干扰自噬活化的机制研究
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 SH-SY5Y细胞培养、传代和处理
        2.3 测定指标及方法
            2.3.1 细胞活力和毒性分析
            2.3.2 Western blot检测相关蛋白表达水平
            2.3.3 细胞凋亡检测
            2.3.4 细胞自噬水平分析
            2.3.5 激光共聚焦观察HMGB1与α-Syn、HMGB1与Beclin1、Beclin1 与Bcl2 的共定位以及HMGB1 的亚细胞定位情况
            2.3.6 免疫共沉淀分析胞浆内HMGB1与α-Syn、HMGB1与Beclin1、Beclin1与Bcl2 蛋白间相互作用
            2.3.7 Real-time PCR检测HMGB1 mRNA水平
            2.3.8 Ad-mCherry-CFP-LC3B腺病毒检测自噬流变化
        2.4 统计分析
    3 结果
        3.1 锰的细胞毒性分析
        3.2 锰暴露诱导HMGB1 发生胞浆转位
        3.3 锰暴露对HMGB1与Beclin1 蛋白相互作用的影响
        3.4 锰对SH-SY5Y细胞自噬的影响
        3.5 锰诱导α-Syn过表达干扰HMGB1与Beclin1、Beclin1与Bcl2 的结合
            3.5.1 锰诱导α-Syn、Bcl2 蛋白表达增多
            3.5.2 锰诱导SH-SY5Y细胞胞浆中α-Syn与 HMGB1 结合增多
            3.5.3 锰暴露引起Beclin1与Bcl2 结合增多
        3.6 Cory B可以缓解锰引起的神经细胞损伤和自噬功能障碍
            3.6.1 Cory B缓解锰引起的细胞损伤
            3.6.2 Cory B缓解锰引起自噬功能异常
        3.7 Cory B可以解离α-Syn与 HMGB1 的结合,增强HMGB1与Beclin1,减弱Beclin1与Bcl2 的结合
            3.7.1 Cory B对 α-Syn、Bcl2 表达的影响
            3.7.2 Cory B减弱锰诱导的α-Syn与 HMGB1 结合增多
            3.7.3 Cory B改善锰诱导HMGB1与Beclin1 结合减少
            3.7.4 Cory B减弱锰诱导的Beclin1与Bcl2 结合增多
        3.8 Cory B可以调控mTOR信号通路,影响自噬
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：3688050