牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立

发布时间：2022-10-20 12:55

　　食源性疾病是全球最重要的公共卫生问题之一,导致食源性疾病的有病原微生物、寄生虫及其代谢产物、天然毒素以及化学性有毒有害物质等等。微生物引起的食源性疾病是全球食品安全面临的最重要挑战之一。在发达国家70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的,在我国甚至达到90%;引起沙门氏菌中毒的食品中,蛋类、奶类等动物性产品约占90%,沙门氏菌生存能力较强,可在乳制品中生存几个月。单增李斯特菌广泛存在于自然界中,且在冷藏温度4℃下依然能够生长,引起单增李斯特菌食物中毒的食品主要有:奶及奶制品、肉制品、水产品、蔬菜及水果,其中以乳制品最为常见,单增李斯特菌能够给高风险人群带来严重的感染性疾病。志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引起人类细菌性痢疾中最为常见的食源性致病菌,该菌也是食品卫生相关法规及标准中要求必须检测的项目之一。本文以牛奶中常见的食源性致病菌单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌种,利用环介导等温扩增技术和高分辨率熔解曲线技术建立了多重LAMP检测体系和多重HAND-HRM检测体系,结果如下:1.针对单增李斯特菌溶血素蛋白（hly）基因、沙门氏菌侵袭蛋白A（invA）基因和志贺氏菌侵袭性质粒抗... 

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 绪论
    第一节 食源性疾病
    第二节 三种食源性致病菌
        一、单增李斯特菌
            1. 单增李斯特菌概述
            2. 单增李斯特菌的危害
        二、沙门氏菌
            1. 沙门氏菌概述
            2. 沙门氏菌的危害
        三、志贺氏菌
            1. 志贺氏菌的分类
            2. 志贺氏菌的危害
    第三节 环介导等温扩增(LAMP)技术
    第四节 高分辨率熔解曲线(HRM)技术
        一、HRM技术的原理
        二、饱和荧光染料
        三、HRM技术的特点
    第五节 同源加尾系统
    第六节 研究内容与意义
        一、研究内容
            1. 多重环介导等温扩增反应体系的建立
            2. 基于HAND系统的高分辨率熔解曲线检测方法的建立
        二、研究意义
第二章 多重LAMP检测体系的建立
    第一节 实验材料与设备
        一、材料
        二、试剂与仪器
        三、培养基
            1. 营养琼脂培养基
            2. 3%NaCl营养琼脂
            3. 胰蛋白胨大豆酵母浸膏(TSA-YE)培养基
    第二节 方法
        一、细菌基因组DNA的提取
        二、引物设计与合成
        三、LAMP反应体系及优化
        四、多重LAMP反应体系的优化
        五、多重LAMP反应的特异性及灵敏度检测
        六、LAMP扩增产物测序
        七、多重LAMP体系对模拟污染牛奶的检测
        八、多重LAMP体系对实际牛奶样品的检测
    第三节 结果
        一、引物设计
            1. 单增李斯特菌引物设计
            2. 沙门氏菌引物设计
            3. 志贺氏菌引物设计
        二、最佳引物筛选
        三、单重LAMP反应体系及优化
            1. 镁离子浓度
            2. 甜菜碱浓度
            3. 引物浓度的多重体系优化
        四、多重LAMP反应的特异性检测结果
        五、多重LAMP反应的灵敏度检测结果
        六、LAMP扩增产物测序结果
        七、模拟污染牛奶模型中多重LAMP灵敏度检测
        八、实际牛奶样品的多重LAMP检测结果
    第四节 讨论
    第五节 本章小结
第三章 基于HAND系统的多重高分辨率熔解曲线检测系统的建立
    第一节 实验材料与设备
        一、材料
        二、试剂与仪器
        三、培养基
    第二节 方法
        一、细菌基因组DNA的提取
        二、引物设计与合成
        三、基于HAND系统单重反应体系及优化
        四、多重HAND-HRM反应体系的优化
        五、多重HAND-HRM体系的特异性检测
        六、多重HAND-HRM体系的灵敏度检测
        七、评估不同模板浓度对多重HAND-HRM体系检测的影响
        八、多重HAND-HRM体系稳定性检测
        九、多重HAND-HRM体系扩增产物测序
        十、多重HAND-HRM体系对模拟污染牛奶的检测
        十一、多重HAND-HRM体系对实际牛奶样品的检测
    第三节 结果
        一、引物设计结果
            1. 单增李斯特菌引物
            2. 沙门氏菌引物
            3. 志贺氏菌引物
        二、基于HAND系统单重反应体系及优化
            1. 引物筛选
            2. 退火温度优化
        三、多重HAND-HRM反应体系的优化
        四、多重HAND-HRM体系的特异性检测结果
        五、多重HAND-HRM体系的灵敏度检测结果
        六、不同模板浓度对多重HAND-HRM体系检测影响的评估结果
        七、多重HAND-HRM体系稳定性检测结果
        八、多重HAND-HRM体系扩增产物测序
        九、多重HAND-HRM体系对模拟污染牛奶的检测
        十、实际牛奶样品的多重HAND-HRM检测结果
    第四节 讨论
    第五节 本章小结
第四章 结论与展望
    第一节 结论
    第二节 展望
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录


【参考文献】：
期刊论文
[1]2017年晋中市榆次区食源性疾病主动监测实验室检测结果分析[J]. 李丽燕,李静虹.  临床检验杂志(电子版). 2019(02)
[2]食源性致病菌研究动态[J]. 黄金林.  食品安全质量检测学报. 2018(07)
[3]环介导等温扩增技术快速检测肉中单增李斯特菌[J]. 姜霞,满朝新,赵玥明,周文琦,曲艳艳,庞心怡,姜毓君.  中国食物与营养. 2015(11)
[4]环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌的研究[J]. 马晓燕,张会彦,宋明明,张先舟,王羽,张伟.  安徽农业科学. 2011(14)
[5]志贺氏菌病发病机制的研究进展[J]. 康静静,杨玉荣,梁宏德.  中国农业科学. 2011(09)
[6]牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法的建立[J]. 程媛媛,张彦明,向华,康恺,李艳明,徐磊,董玲娟,张三东.  西北农林科技大学学报(自然科学版). 2011(03)
[7]食源性沙门氏菌检测方法的研究进展[J]. 黄文宇,柳陈坚.  生物技术. 2009(03)
[8]副溶血弧菌LAMP检测方法的建立[J]. 徐芊,孙晓红,赵勇,潘迎捷.  中国生物工程杂志. 2007(12)

硕士论文
[1]应用特异性免疫磁珠快速检测单增李斯特菌[D]. 闻一鸣.暨南大学 2013
[2]可视化LAMP法快速检测牛乳中单增李斯特菌的研究[D]. 何晓伟.东北农业大学 2013
[3]鸡源鲍氏志贺氏菌及其脂多糖对雏鸡的致病性研究[D]. 潘国民.河南农业大学 2010



本文编号：3694549