无机砷对大鼠HSC纤维化改变及DNMTs表达的实验观察
发布时间：2017-05-17 08:14
本文关键词：无机砷对大鼠HSC纤维化改变及DNMTs表达的实验观察，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:研究不同剂量无机砷刺激大鼠肝星状细胞(HSC)后其纤维化情况,观察在此过程中DNMTs的变化,为进一步阐述无机砷致肝损伤的作用机制提供依据。方法:1.采用MTT还原法检测细胞生长情况和细胞活力;确定LC50和染毒浓度即亚砷酸钠(As3+)低、中、高剂量组和砷酸钠(As5+)低、中、高剂量组。2.流式细胞仪(FCM)检测不同剂量和时间点的大鼠HSC-T6的凋亡情况。3.酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)检测无机砷干预大鼠HSC-T6后的Ⅰ型胶原(COL-1)、Ⅲ型胶原(COL-3)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量。4.通过实时荧光定量(Real-Time Quantitative PCR)检测无机砷干预大鼠HSC-T6后TGF-β1、DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3l的mRNA的表达水平。5.蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot检测无机砷干预大鼠HSC-T6后TGF-β1和DNMT3a在细胞内的蛋白表达。结果:1.无机砷染毒HSC-T6细胞48h时,测得As3+的LC50为60.00μmol/L,As5+的LC50为93.00μmol/L,即亚砷酸钠组的低、中、高剂量依次是5μmol/L、15μmol/L、25μmol/L。砷酸钠组的低、中、高剂量依次是20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L。对照组为0μmol/L。细胞的增殖活力随剂量时间升高而降低。2.在24h时,除五价砷低剂量组外其它染毒组的凋亡率都高于对照组(P㩳0.05);48h和72h时随着染砷浓度的增加,凋亡率逐渐升高(P㩳0.05)。浓度一定时,所有染砷组随着染砷时间的增加凋亡率升高(P㩳0.05)。3.各染砷组的COL-1、COL-3、α-SMA的含量随染砷时间和染砷剂量的增加而升高(P㩳0.05)。4.与对照组相比TGF-β1的mRNA表达水平随染砷剂量的增加而上调(P㩳0.05);相同浓度随着染砷时间的延长,TGF-β1的mRNA表达水平也在不断的增加(P㩳0.05)。5.在同一时间下,DNMT1的mRNA表达量随染砷浓度的升高而上调(P㩳0.05);同一浓度下,DNMT1mRNA的表达量随染砷时间递增而下调(P㩳0.05)。6.同一时间下,随三价砷染毒剂量的升高DNMT2mRNA的表达水平呈现为上调(P㩳0.05),而五价砷染毒剂量的升高DNMT2mRNA的表达水平呈现为下调(P㩳0.05)。同一浓度下,在48h时三价中、高剂量组与五价低、高剂量组DNMT2mRNA的表达水平为上调(P㩳0.05)。7.DNMT3a的mRNA的表达量随染砷剂量的升高在降低(P㩳0.05),但仍是上调;同一剂量组下,随染毒时间的延长DNMT3a的mRNA表达水平为上调(P㩳0.05)。8.同一时间下,24h时三价砷低剂量组DNMT3b的mRNA是表达上调(P㩳0.05),其它组都是表达下调(P㩳0.05);48h时DNMT3b的mRNA在三价砷中剂量组表达下调,但在三价砷高剂量组及五价砷低、高剂量组表达上调(P㩳0.05)。浓度一定的情况下,48h、72h时DNMT3b的mRNA的表达在三价砷中剂量与五价砷中剂量为下调(P㩳0.05),其余为上调(P㩳0.05)。9.24h时三价砷高剂量组,五价砷中、高剂量组DNMT3l的mRNA表达为上调(P㩳0.05),48h时三价砷中、高剂量组DNMT3l的mRNA表达为上调(P㩳0.05)。72h时三价砷中剂量组显示为上调(P㩳0.05)。同一浓度下,在48h、72h时的所有染砷组的DNMT3l的mRNA的表达水平除三价中剂量是上调,其它组是下调(P㩳0.05)。10.对无机砷诱导HSC-T6细胞72h时的各基因做相关分析,TGF-β1mRNA的表达与DNMT2mRNA的表达和DNMT3amRNA的表达呈高度正相关(P㩳0.01)。11.Western Blot检测显示TGF-β1和DNMT3a在细胞内的蛋白表达随时间和浓度的增加而上升。且不同组间和不同时间差异有统计学意义(P㩳0.05)。结论:无机砷刺激大鼠HSC-T6后,会引起细胞的凋亡率升高,增殖活力表现为低浓度促进,高浓度抑制;肝纤维化相关胶原COL-1、COL-3和α-SMA的含量有明显升高,TGF-β1 mRNA和蛋白的表达均升高,提示无机砷刺激HSC-T6后可引起纤维化。纤维化时DNMT1、DNMT3a表现为上调,DNMT2表现为下调,DNMT3l除三价砷中剂量为上调外,其它组都是下调,DNMT3b变化趋势不明显,肝纤维化机制需做进一步研究。
【关键词】：无机砷 肝纤维化 肝星状细胞 DNA甲基转移酶 转化生长因子β1
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：
- 中英文缩略词对照表5-8
- 摘要8-10
- ABSTRACT10-13
- 前言13-16
- 材料与方法16-24
- 1. 材料16-17
- 2. 方法17-23
- 3. 统计学分析23-24
- 结果24-44
- 讨论44-50
- 小结50-51
- 致谢51-52
- 参考文献52-57
- 综述57-66
- 参考文献63-66
- 攻读硕士学位期间发表的学位论文66-67
- 导师评阅表67
本文关键词：无机砷对大鼠HSC纤维化改变及DNMTs表达的实验观察，由笔耕文化传播整理发布。
本文编号：372868
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