骨髓间充质干细胞对镉致大鼠肾脏损伤的修复作用研究
本文关键词：骨髓间充质干细胞对镉致大鼠肾脏损伤的修复作用研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：自20世纪初发现镉以来，镉在人们的日常生产生活中出现日趋频繁。电镀、采矿、冶炼、染料及化工废水的排放等污染水源及土壤，造成人们食用的农作物及鱼虾体内镉含量超标。镉在人体内的生物半衰期长达10-25年，并且镉的清除率低，最终造成镉在人体内大量蓄积。肾脏可蓄积镉吸收量的1/3，是镉中毒的重要靶器官，肾脏的结构及功能损伤不容忽视。目前对镉中毒患者主要以对症支持治疗为主，但只能使病情缓解，无法修复肾脏损伤，临床上迫切需要一种科学有效的方法来治疗镉对机体造成的肾脏损伤。骨髓间充质干细胞（bonemesenchymal stem cell，BMSCs）具有来源方便、稳定、易于体外分离培养、增殖能力强、免疫原性弱、多向分化潜能、移植后向受损部位归巢并修复其损伤的特点，在组织损伤修复方面具有良好的发展潜能和广阔的应用前景，近年来备受医学研究青睐。已有研究表明：BMSCs对于缺血再灌注引起的肾脏损伤和烧伤引起的肝脏损伤等有良好的修复效果，但关于BMSCs能否修复镉染毒所致的肾脏组织损伤国内外还未见详尽报道。因此本课题将BMSCs移植进镉染毒所致肾脏损伤的大鼠体内，观察其对镉染毒所致大鼠肾脏损伤的修复作用，并初步探讨其修复机制，希望为临床治疗镉染毒所致肾脏损伤提供新的思路和一定的理论依据。 目的：探讨骨髓间充质干细胞静脉移植后对镉致肾损伤的修复作用，并初步探讨其作用机制。 方法：取Wistar大鼠乳鼠骨髓细胞，采用贴壁培养法纯化、扩增BMSCs。利用流式细胞仪检测BMSCs周期及表面标志物CD44、CD45和CD90。选用30只成年雄性Wistar大鼠，随机分为空白对照组、模型组（经球后静脉注入生理盐水0.2mL）和细胞治疗组（经球后静脉注入BMSCs0.2mL，1×107个），每组10只。给予0.4mgkg-1体重的CdCl2溶液染毒，每周5次，连续染毒5周，制备大鼠镉致肾脏损伤模型，空白对照组给予等量生理盐水。染毒结束后，将氯甲基苯甲酰胺（CM-Dil）标记的BMSCs经球后静脉移植到细胞治疗组大鼠体内，空白对照组及模型组给予同等体积的生理盐水，移植后每日观察大鼠一般状况及体质量变化。细胞移植2周后取大鼠血清检测肌酐（CR）、尿素氮（BUN）和β2-微球蛋白（β2-MG）含量；取肾脏组织测定肾脏组织内镉水平；计算脏器系数；HE染色进行病理组织学观察；TUNEL法检测肾脏组织细胞凋亡；免疫组织化学法检测Bax、 Bcl-2、Caspase-3、Beclin1及LC3B的表达；Western blot法检测肾脏组织内Bax、Bcl-2的相对表达水平。肾脏组织冰冻切片后，采用激光共聚焦显微镜观察BMSCs在细胞治疗组大鼠肾脏组织内的定植情况。 结果： BMSCs贴壁生长状态良好，流式细胞仪检测显示BMSCs阳性表达CD44和CD90，基本不表达CD45，细胞大部分处于相对不活跃的静止期。细胞移植2周后，模型组大鼠明显精神萎靡且少动，细胞治疗组大鼠精神行为状态明显好于模型组，且细胞治疗组大鼠体质量显著高于模型组（P＜0.05）。生化法检测，细胞治疗组大鼠肾脏功能显著优于模型组（P＜0.05）。脏器系数结果表明，与空白对照组相比，模型组大鼠肾脏脏器系数显著降低（P＜0.05），与模型组相比，细胞治疗组大鼠肾脏脏器系数显著增高（P＜0.05）。原子吸收法检测，空白对照组大鼠肾脏内仅有微量镉蓄积，模型组大鼠与细胞治疗组大鼠肾脏组织内蓄积大量镉，二者无明显差别。病理组织学观察显示，模型组大鼠肾脏肾小管及肾小球存在形态学损伤，而细胞治疗组大鼠肾脏病理损伤明显轻于模型组。TUNEL法检测，细胞治疗组大鼠肾脏细胞凋亡率显著低于模型组（P＜0.05）。免疫组织化学法检测，与空白对照组相比，模型组大鼠肾脏组织内Bax、Caspase-3、Beclin1及LC3B蛋白表达水平显著增加（P＜0.05），Bcl-2表达显著降低（P＜0.05），与模型组相比，细胞治疗组大鼠肾脏组织内Bax、Caspase-3、Beclin1及LC3B蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），Bcl-2表达显著增加（P＜0.05）。Western blot法检测，与空白对照组相比，模型组大鼠肾脏组织内Bax蛋白相对表达水平显著升高（P＜0.05），Bcl-2相对表达水平显著降低（P＜0.05），而Bcl-2与Bax比值(Bcl-2/Bax)显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，细胞治疗组大鼠肾脏组织内凋亡蛋白Bax相对表达水平显著降低（P＜0.05），Bcl-2相对表达水平显著升高（P＜0.05），而Bcl-2/Bax显著升高（P＜0.05）。激光共聚焦显微镜观察显示，，细胞治疗组大鼠肾脏组织内存在CM-Dil标记的红色BMSCs。 结论： BMSCs经静脉移植后，能够在由镉导致的受损肾脏组织内定植，并且对镉致肾脏损伤具有明显的修复效果，其修复肾脏损伤机制可能与抑制肾脏细胞凋亡及抑制细胞自噬有关。
【关键词】：镉 肾脏损伤 骨髓间充质干细胞 细胞移植 凋亡 自噬
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：
- 中文摘要4-7
- Abstract7-11
- 英文缩略词11-15
- 第1章 绪论15-25
- 1.1 镉15-18
- 1.1.1 镉概述15
- 1.1.2 镉的吸收及蓄积15
- 1.1.3 镉的相关安全标准15-16
- 1.1.4 镉污染事件16-17
- 1.1.5 镉治疗现状17-18
- 1.2 干细胞18-19
- 1.2.1 干细胞概述18
- 1.2.2 干细胞分类18-19
- 1.3 骨髓间充质干细胞（BMSCs）19-20
- 1.3.1 BMSCs 概述19
- 1.3.2 BMSCs 的特征19
- 1.3.3 BMSCs 的自我更新潜能19
- 1.3.4 BMSCs 的表面标志19-20
- 1.3.5 BMSCs 治疗的安全性20
- 1.3.6 BMSCs 向受损部位“归巢”20
- 1.4 镉对肾脏组织的损伤机制20-22
- 1.4.1 氧化损伤21
- 1.4.2 Ca~(2+)稳态失调21
- 1.4.3 线粒体应激21-22
- 1.4.4 内质网应激22
- 1.5 细胞凋亡相关机制通路22-23
- 1.5.1 线粒体介导的细胞凋亡通路22
- 1.5.2 内质网介导的细胞凋亡通路22-23
- 1.5.3 P53 介导的细胞凋亡通路23
- 1.6 镉与肾脏组织的细胞自噬23-25
- 第2章 材料与方法25-35
- 2.1 材料与仪器25-28
- 2.1.1 主要试剂25-26
- 2.1.2 器材26-27
- 2.1.3 主要试剂的配制27-28
- 2.1.4 实验动物28
- 2.2 方法28-35
- 2.2.1 BMSCs 的分离、培养和扩增28-29
- 2.2.2 流式细胞仪测定 BMSCs 细胞周期29
- 2.2.3 流式细胞仪鉴定 BMSCs 表面标志29
- 2.2.4 动物分组29
- 2.2.5 大鼠镉染毒肾脏损伤模型的制备29-30
- 2.2.6 CM-Dil 标记 BMSCs 和移植30
- 2.2.7 一般状态、体重30
- 2.2.8 肾功能生化指标检测30
- 2.2.9 脏器系数测定30
- 2.2.10 原子吸收法测定肾脏组织内镉水平30-31
- 2.2.11 肾脏组织 HE 染色病理组织学观察31
- 2.2.12 肾脏组织 TUNEL 法染色31-32
- 2.2.13 免疫组织化学法检测相关蛋白的表达32-33
- 2.2.14 Western blot 法检测肾脏组织内 Bcl-2、Bax 表达33-34
- 2.2.15 激光共聚焦显微镜观察 BMSCs 在肾脏内定植34
- 2.2.16 统计学分析34-35
- 第3章 结果35-47
- 3.1 BMSCs 的分离、培养与鉴定35-37
- 3.1.1 BMSCs 的培养35
- 3.1.2 BMSCs 细胞周期35-36
- 3.1.3 BMSCs 表面标志36-37
- 3.2 镉致肾脏损伤模型制备37-38
- 3.2.1 HE 染色病理组织学观察37
- 3.2.2 肾功能生化检测37-38
- 3.3 BMSCs 移植修复镉致大鼠肾脏损伤38-47
- 3.3.1 大鼠一般状态38
- 3.3.2 大鼠体质量变化38
- 3.3.3 肾功能生化检测38-39
- 3.3.4 肾脏脏器系数变化39
- 3.3.5 原子吸收法测定肾脏镉含量39
- 3.3.6 HE 病理组织学观察39-40
- 3.3.7 TUNEL 检测肾脏组织内细胞凋亡40-41
- 3.3.8 免疫组织化学法检测 Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3B的表达41-45
- 3.3.9 Western blot 检测 Bcl-2、Bax 蛋白表达45
- 3.3.10 BMSCs 在肾脏中定植情况45-47
- 第4章 讨论47-53
- 4.1 BMSCs 的鉴定48-49
- 4.2 镉致肾脏损伤大鼠模型的建立49
- 4.3 BMSCs 对镉致肾脏损伤的修复作用49
- 4.4 BMSCs 通过抗细胞凋亡机制修复镉致肾脏损伤49-51
- 4.5 BMSCs 通过抗细胞自噬机制修复镉致肾脏损伤51
- 4.6 BMSCs 向受损肾脏的归巢51-53
- 结论53-54
- 参考文献54-58
- 作者简介58-59
- 致谢59
【参考文献】
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