猪肉生产链金黄色葡萄球菌分布、耐药性及基因分型的研究

发布时间：2017-09-25 02:14

  本文关键词：猪肉生产链金黄色葡萄球菌分布、耐药性及基因分型的研究

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【摘要】：金黄色葡萄球菌作为生猪肉生产链中食源性疾病的重要条件致病菌之一能够通过食物链传播至人类,给人类生命健康构成严重威胁。本研究从某养殖场、屠宰车间、市场及其成品采集的507份猪源样本,根据GB4789.10-2010对样品进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定,采用纸片扩散法(K-B)对14种抗生素与微量肉汤稀释法及E-test法对万古霉素进行抗生素敏感试验,采用PCR方法验证耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),并对金黄色葡萄球菌的耐药基因及毒力基因进行检测,用多位点序列分析分型(MLST)及金黄色葡萄球菌表面蛋白A基因多态性分型(spa)对MRSA进行分子分型研究。具体内容如下:1.采样共507份,分离率达26.82%。源头养殖场中环境中栅栏门、地面、猪鼻拭子等环境样中,金黄色葡萄球菌分离率为17.26%;而屠宰环节的的176份里中,有39.63%的金黄色葡萄球菌检出率;采自储存车间里的样品,分离率达16.98%;各大超市及市场生猪肉里金葡的分离率是30%。2.对分离得到的136株菌采用CLSI2012推荐的纸片扩散法对14种抗生素进行药物敏感试验,136株菌对14种抗生素呈现不同程度的耐药性:对青霉素耐药率较高,达92.64%;对四环素、克林霉素、克拉霉素、复方新诺明、环丙沙星、庆大霉素、氯霉素的耐药率在24.26%-56.61%之间;本次分离菌株多重耐药菌株数达56.6%。不同来源的金葡对14种抗生素显示不同的耐药谱。3.对耐药基因及毒力基因的PCR结果显示,本试验检测的136株菌中四环素基因tetK检出率最高,达90.44%,来自市场生猪肉样本的金葡检出tetM携带率最高,为24.24%。耐大环内酯类抗生素菌株中耐药基因ermA/B/C检出率为16.42%,其中ermB检出率较高(11.76%,16/136)。不同来源的菌株中毒力基因的检出率各有差异,各类毒力基因中a-溶血素(hla)阳性菌株检测率最高,总检出率为48.5%。根据PCR检测结果,共检测携带mecA基因的21株,检测率为15.44%(21/136)。本次实验中尚未检测到mecC基因与杀白细胞毒素基因(pvl)。4.对分离的MRSA进行分子流行病学研究,采用多位点序列分析分型(MLST)及金黄色葡萄球菌表面蛋白A基因多态性分型(spa)方法进行分析,结果显示,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行MLST序列分型分析,分型后得到7个型别:ST9、ST1、ST398、ST188、ST239、ST1516以及ST7,其中ST9为我国发现养殖场内MRSA优势型。对SPA分型,本实验spa基因重复序列数为5-11个共分得7个型别,分布为t034、t037、t091、t189、t899、t1775和t1852,以t899为主(27.78%)。综上所述,生猪肉生产链中金黄色葡萄球菌污染较为严重,各个环节的分离得到的葡萄球菌的耐药谱及毒力基因各具特点,为猪肉生产链中的金黄色葡萄球菌的耐药性及流行病学相关研究奠定基础。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 MRSA 耐药基因 毒力基因 MLST spa
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R155.5
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 英文缩写表12-14
• 第一章 绪论14-26
• 1.1 金黄色葡萄球菌与养殖场及加工过程环境安全14-17
• 1.1.1 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物学特性及流行特点14-15
• 1.1.2 MRSA的生物学特性及流行特点15-17
• 1.1.3 LA-MRSA的研究现状17
• 1.2 耐药机制及毒力机制17-22
• 1.2.1 金黄色葡萄球菌耐药机制17-20
• 1.2.2 毒力机制20-22
• 1.3 金黄色葡萄球菌分型方法22-24
• 1.3.1 金黄色葡萄球菌分型方法概述22
• 1.3.2 多位点序列分析 （MLST）22-23
• 1.3.3 金黄色葡萄球菌表面蛋白A基因多态性分型 (spa)23-24
• 1.3.4 葡萄球菌基因盒分型（SCCmec）24
• 1.4 本课题的研究意义及主要内容24-26
• 第二章 样品的采集及金黄色葡萄球菌的分离26-32
• 2.1 引言26
• 2.2 材料和方法26-28
• 2.2.1 主要仪器和设备26-27
• 2.2.2 主要实验材料27
• 2.2.3 主要试剂的配置27-28
• 2.3.试验方法28-30
• 2.3.1 金黄色葡萄球菌的分离及鉴定28-30
• 2.4 结果分析30
• 2.4.1 金黄色葡萄球菌的检出状况30
• 2.4.2 不同流通领域金黄色葡萄球菌分离情况30
• 2.5 小结30-32
• 第三章 金黄色葡萄球菌耐药性研究32-44
• 3.1 引言32
• 3.2 实验材料设备及试验方法32-37
• 3.2.1 实验菌株32
• 3.2.2 实验设备32-33
• 3.2.3 实验材料33
• 3.2.4 主要培养基的配置33-34
• 3.2.5 试验方法34-37
• 3.3 结果与分析37-42
• 3.3.1 金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药情况37-38
• 3.3.2 不同来源金黄色葡萄球菌耐药状况38-39
• 3.3.3 金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药状况39-40
• 3.3.4 金黄色葡萄球菌的多重耐药性40-41
• 3.3.5 MRSA与MSSA耐药状况对比41-42
• 3.4 小结42-44
• 第四章 耐药基因及毒力基因的研究44-53
• 4.1 引言44
• 4.2 材料和方法44-45
• 4.2.1 主要仪器和设备44-45
• 4.2.2 主要试剂耗材45
• 4.3 实验方法45-48
• 4.3.1 DNA模板的制备45-46
• 4.3.2 引物的合成46-47
• 4.3.3 PCR反应体系47
• 4.3.4 PCR反应条件47
• 4.3.5 电泳检测PCR产物47-48
• 4.4 实验结果48-51
• 4.4.1 不同样本来源毒力基因及耐药基因的检测结果48-49
• 4.4.2 不同来源的金黄色葡萄球菌毒素基因的分布49-50
• 4.4.3 耐药表型和基因型的比较50
• 4.4.4 PCR检测mecA基因和mecC基因50-51
• 4.4.5 苯唑西林法，头孢西丁与PCR法检测MRSA的比较51
• 4.5 小结51-53
• 第五章 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MLST及spa分型的研究53-62
• 5.1 引言53
• 5.2 材料和方法53-55
• 5.2.1 菌株53
• 5.2.2 主要仪器仪器和设备53-54
• 5.2.3 主要试剂耗材54-55
• 5.3 实验方法55-57
• 5.3.1 DNA模板的制备55
• 5.3.2 MLST分型及spa分型引物55
• 5.3.3 反应体系55-56
• 5.3.4 PCR反应条件56
• 5.3.5 电泳检测56-57
• 5.3.6 产物测序及结果处理57
• 5.4 结果与分析57-61
• 5.4.1 耐甲氧西林金葡菌MLST序列分型结果57-58
• 5.4.2 spa分型结果58-59
• 5.4.3 对MLST相关性分析59
• 5.4.4 MLST分型及spa分型与耐药谱结果相关性59-61
• 5.5 小结61-62
• 结论与展望62-64
• 参考文献64-77
• 附录77-85
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果85-86
• 致谢86-87
• 答辩委员会对论文的评定意见87

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本文编号：914786