线粒体介导砷致人支气管上皮细胞（HBE）氧化损伤的研究

发布时间：2017-09-26 08:26

  本文关键词：线粒体介导砷致人支气管上皮细胞（HBE）氧化损伤的研究

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【摘要】：目的探讨线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)在亚砷酸钠(Sodium arsenite,NaAsO2)染毒致人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)氧化损伤中的作用,为阐明砷毒性作用的分子机制提供新的研究途径。方法1.线粒体DNA拷贝数降低HBE细胞模型的建立:结合相关文献资料,用含微量溴化乙锭(ethidium bromide,EtBr)的培养基持续诱导,从而构建mt DNA拷贝数降低的HBE细胞株。通过营养缺陷、real-time PCR鉴定HBE细胞内mt DNA缺失情况,将mt DNA拷贝数降低的HBE细胞定义为ρ-HBE,而将未经EtBr处理的对照组HBE细胞定义为ρ+HBE。根据方法2中得出的染毒剂量,用Western blot检测细胞内增殖相关蛋白NQO1的水平,验证mt DNA缺失细胞增殖情况。2.染毒剂量确定:以ρ+HBE和ρ-HBE两组细胞为研究对象,用不同浓度(0~160μM)的亚砷酸钠进行细胞染毒,采用MTT细胞毒性检测试剂盒检测HBE细胞存活率。通过SPSS19.0软件计算得出两组细胞的IC50和细胞存活率在70%以上的NaAsO2浓度,确定后续NaAsO2染毒剂量。3.氧化应激相关指标检测:用不同浓度NaAsO2(0、1、2、4、8、16μM)染毒处理ρ+HBE和ρ-HBE细胞24h,收集细胞,用流式细胞仪检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,用硫代巴比妥酸(TBA)比色法检测细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,用WST-1法检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力,用DTNB速率比色法检测细胞内谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,用Western blot方法检测Keap1/Nrf2-ARE抗氧化信号通路相关蛋白Nrf2、Keap1及下游血红素单加氧酶(heme oxygenase 1,HO-1)表达情况。4.细胞凋亡相关指标检测:实验染毒方案同方法3,通过Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白水平及变化情况。结果1.线粒体dna拷贝数降低hbe细胞模型的建立:hbe细胞在含有50ng/mletbr的诱导培养基中持续培养7d后,在ρ0(mtdna完全缺失细胞)筛选培养基中培养7d,细胞肿胀,结构模糊不清,且出现大量漂浮及死亡现象;real-timepcr结果显示,etbr诱导培养的hbe细胞mtdna拷贝数降低了97.30%;用不同浓度naaso2(0、1、2、4、8、16μm)处理两组细胞24h后,对照组ρ+hbe细胞内增殖相关蛋白nqo1水平呈现先增加后降低的趋势,ρ-hbe细胞内nqo1蛋白水平呈现逐渐下降的趋势,且均低于ρ+hbe细胞(p0.05)。2.不同剂量亚砷酸钠作用对两组hbe细胞存活率的影响:不同浓度(0~160μm)的naaso2作用于两组细胞24h,mtt细胞毒性结果显示,随着naaso2染毒浓度的增加,两组细胞存活率均呈现降低的趋势,且在相同浓度naaso2作用下,ρ-hbe细胞相对存活率均高于ρ+hbe细胞,利用spss19.0计算得出亚砷酸钠染毒ρ-hbe细胞ic50为88.35μm,ρ+hbe细胞为75.34μm,同时细胞增殖率在70%以上的naaso2浓度分别为≤26.83μm(ρ-hbe)、≤14.66μm(ρ+hbe),由此确定naaso2的后续染毒剂量为0、1、2、4、8、16μmol/l。3.不同剂量亚砷酸钠作用对两组hbe细胞氧化应激水平的影响:随着naaso2染毒浓度的增加,ρ+hbe细胞内ros和mda水平呈现增加的趋势,而ρ-hbe细胞则呈现出不升反降的趋势,且均高于ρ+hbe细胞(p0.05);随着naaso2染毒浓度的增加,两组细胞内sod酶活力水平逐渐降低,在小于8μmnaaso2作用下,ρ-hbe细胞内sod酶活力水平高于ρ+hbe细胞(p0.05),而在16μmnaaso2作用下,ρ-hbe细胞内sod酶活力水平则低于ρ+hbe细胞(p0.05);两组细胞内gsh、gsh/gssg水平随着naaso2浓度的增加呈现先增加后降低的趋势,且ρ-hbe细胞内gsh水平在0~4μmnaaso2染毒时高于ρ+hbe细胞,而在8~16μmnaaso2染毒时则低于ρ+hbe细胞(p0.05),ρ-hbe细胞内gsh/gssg比值水平均明显低于ρ+hbe细胞(p0.05);随着naaso2浓度的不断增加,两组细胞内nrf2和keap1蛋白水平呈现先增加后降低的趋势,ρ-hbe细胞内nrf2和keap1水平相较于ρ+hbe细胞呈现持续高水平状态,且均高于ρ+hbe细胞(p0.05);两组细胞内ho-1蛋白水平随着naaso2染毒浓度的增加而增加,且ρ-hbe细胞内ho-1水平要高于ρ+hbe细胞(p0.05)。4.不同剂量亚砷酸钠作用对两组HBE细胞内凋亡相关蛋白水平的影响:随着NaAsO2染毒浓度的增加,ρ+HBE细胞内Bcl-2、Bax蛋白水平均呈现先增加后降低的趋势,而ρ-HBE细胞内Bcl-2、Bax蛋白水平则逐渐降低;在0~4μM NaAsO2染毒时,ρ-HBE细胞内Bcl-2蛋白水平高于ρ+HBE细胞,而在8~16μM NaAsO2染毒时则低于ρ+HBE细胞(P0.05);ρ-HBE细胞内Bax蛋白水平均低于ρ+HBE细胞(P0.05);两组细胞内Bcl-2/Bax比值则随着NaAsO2染毒浓度的增加均呈现先增加后降低的趋势,且ρ-HBE细胞内Bcl-2/Bax比值均高于ρ+HBE细胞(P0.05);随着NaAsO2浓度的增加,两组细胞内Caspase-9和Cleaved Caspase-9蛋白水平均呈现先增加后降低的趋势,且ρ-HBE细胞内Caspase-9和Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显低于ρ+HBE细胞(P0.05);随着NaAsO2染毒浓度的增加,两组细胞内Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白水平均呈现先增加后降低的趋势,且两组细胞内蛋白趋势相比无明显差别。结论线粒体DNA的存在会在一定程度上减轻砷所致的氧化损伤,同时诱导细胞凋亡以清除受损的细胞,从而达到保护细胞的作用。
【关键词】：亚砷酸钠 人支气管上皮细胞 线粒体DNA 氧化损伤 细胞凋亡
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-15
• 第一部分 线粒体DNA拷贝数降低HBE细胞模型的建立15-27
• 1 材料与方法15-22
• 1.1 材料15-17
• 1.2 实验方法17-22
• 2 结果22-25
• 2.1 细胞培养及营养缺陷鉴定22-23
• 2.2 ρ-HBE细胞mt DNA拷贝数的变化23-24
• 2.3 不同剂量亚砷酸钠染毒对HBE细胞增殖蛋白NQO1的影响24-25
• 3 讨论25-27
• 第二部分 线粒体DNA在不同剂量亚砷酸钠染毒对HBE细胞存活率影响中的作用27-33
• 1 材料与方法27-29
• 1.1 材料27-28
• 1.2 实验方法28-29
• 2 结果29-31
• 2.1 不同剂量亚砷酸钠染毒对HBE细胞存活率的影响29-30
• 2.2 根据SPSS19.0 计算确定后续实验亚砷酸钠的染毒剂量30-31
• 3 讨论31-33
• 第三部分 线粒体DNA在亚砷酸钠诱导HBE细胞氧化应激中的作用33-45
• 1 材料与方法33-38
• 1.1 材料33-35
• 1.2 实验方法35-38
• 2 结果38-41
• 2.1 不同浓度亚砷酸钠诱导两组HBE细胞内ROS、MDA水平的变化38-39
• 2.2 不同浓度亚砷酸钠诱导两组HBE细胞内SOD活力水平的变化39
• 2.3 不同浓度亚砷酸钠诱导两组HBE细胞内GSH水平的变化39-40
• 2.4 不同浓度亚砷酸钠诱导两组HBE细胞Keap1/Nrf2-ARE抗氧化通路水平的变化40-41
• 3 讨论41-45
• 第四部分 线粒体DNA在亚砷酸钠诱导HBE细胞凋亡中的作用45-53
• 1 材料与方法45-47
• 1.1 材料45-46
• 1.2 实验方法46-47
• 2 结果47-50
• 2.1 不同浓度亚砷酸钠诱导两组HBE细胞Bcl-2、Bax蛋白水平的变化47-48
• 2.2 不同浓度亚砷酸钠诱导两组HBE细胞内Bcl-2/Bax比值的变化48
• 2.3 不同浓度亚砷酸钠诱导两组HBE细胞内Caspase-9 比值的变化48-49
• 2.4 不同浓度亚砷酸钠诱导两组HBE细胞内Caspase-3 比值的变化49-50
• 3 讨论50-53
• 结论53-54
• 参考文献54-62
• 综述 线粒体、氧化应激和细胞凋亡62-70
• 参考文献67-70
• 中英文缩略语对照表70-71
• 攻读硕士学位期间发表的文章及科研经历71-73
• 致谢73-75

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本文编号：922502