丙烯酰胺对大鼠突触损伤的毒作用机制研究

发布时间：2017-09-28 02:26

  本文关键词：丙烯酰胺对大鼠突触损伤的毒作用机制研究

  更多相关文章： 丙烯酰胺 谷氨酸 γ-氨基丁酸 突触素Ⅰ 突触囊泡

【摘要】：目的丙烯酰胺(Acrylamide, ACR)是一种水溶性的乙烯基单体,常温下为白色固体结晶,主要用于生产聚丙烯酰胺,广泛应用于饮用水净化、污水处理、化妆品生产、染料、矿石加工、造纸、生物实验(如凝胶色谱和凝胶电泳)等行业,经食用高温烹饪食物也可摄入一定量的ACR。动物实验表明,ACR可经呼吸道、皮肤、胃肠道等多种途径进入机体,具有神经毒性、生殖毒性、遗传毒性和致癌性等(国际癌症研究中心(IARC,1994)已将其列为“人类可能致癌物"2A类)。其中,人类流行病学调查已明确ACR对人体的神经毒性：职业中毒病例常见于聚丙烯酰胺合成、污水处理、建筑工程灌浆等操作,发病人员有明显的神经中毒症状和体征,如四肢无力、共济失调、肢端痛觉过敏、振动觉和位置觉减退等。本研究通过建立ACR亚急性染毒动物模型,探讨ACR对大鼠神经毒性的效应,包括大鼠中枢神经系统氨基酸类神经递质谷氨酸(Glutamate, Glu)和γ-氨基丁酸(y-aminobutyric acid, GABA)的含量改变,中枢神经系统病理损伤及突触囊泡的分布状态,突触素Ⅰ(Synapsin I)、磷酸化突触素Ⅰ(P-Synapsin I)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的蛋白表达变化,以此为ACR所致中枢神经系统疾患提供实验动物学的证据并为其毒作用机制的最终阐明提供一定的实验数据支撑。方法1.建立动物模型：选取成年雄性SD大鼠,随机分为11d实验组和21d实验组：11d实验组设生理盐水(NS)对照组、30mg/kg ACR染毒组和50mg/kg ACR染毒组；21d实验组设生理盐水(NS)对照组、15mg/kg ACR染毒组和30mg/kgACR染毒组；2.体重变化：实验开始后每天称量大鼠体重并记录；3.神经行为变化：实验开始后每天对动物的大体行为表现和异常体征进行观察记录；11d实验组于第7、11d进行步态评分；21d实验组于第7、14、21d进行步态评分；4.中枢神经系统Glu和GABA含量的测定：染毒期结束时,取大鼠大脑皮层和小脑,LC-MS/MS法测定其大脑皮层和小脑的Glu和GABA的含量；5.中枢神经系统病理损伤及突触囊泡分布状态的变化：制备大鼠大脑皮层和小脑石蜡切片,HE染色观察大脑皮层和小脑的病理变化；制备大鼠大脑皮层和小脑标本,电镜观察神经损伤的超微结构并对突触囊泡的分布状态进行定量分析；6.中枢神经系统相关蛋白的组织定位：免疫组化法确定大鼠大脑皮层和小脑Synapsin I、P-Synapsin I的蛋白分布；7.中枢神经系统相关蛋白表达量的变化：Western-blot法测定大鼠大脑皮层和小脑Synapsin I、P-Synapsin I、BDNF蛋白表达量的变化。结果1.体重变化15mg/kg ACR染毒组大鼠体重与对照组相比变化不显著(P0.05)；30mg/kgACR染毒组体重在第13d进入平台期,随后逐步下降；50mg/kg ACR染毒组大鼠体重自第7d开始下降。lld实验组染毒终点时,50mg/kg ACR染毒组大鼠体重与NS对照组、30mg/kg ACR染毒组相比显著降低(P0.05)。21d实验组染毒终点时,30mg/kg ACR染毒组大鼠体重与NS对照组、15mg/kg ACR染毒组相比显著降低(P0.05)。2.神经行为变化15mg/kg ACR染毒组大鼠在染毒期间步态变化不显著,30mg/kg ACR染毒组和50mg/kg ACR染毒组大鼠在染毒期间均出现后肢无力、震颤、拖步直至后肢完全瘫痪。lld实验组在染毒终点时,50mg/kg ACR染毒组大鼠步态评分与NS对照组、30mg/kg ACR染毒组相比显著增加(P0.05)。21d实验组在染毒终点时,30mg/kg ACR染毒组大鼠步态评分与NS对照组、15mg/kg ACR染毒组相比显著增加(P0.05)。3.大脑皮层和小脑Glu和GABA含量的变化(1)兴奋性神经递质：大脑皮层和小脑在不同剂量ACR染毒终点(30mg/kg 21d、50mg/kg11d), Glu含量均显著降低,且降低幅度一致；(2)抑制性神经递质：大脑皮层GABA含量变化在两种染毒条件下并不完全一致,在30mg/kg 21d染毒终点,大脑皮层GABA含量显著增高(P0.05),但在50mg/kg 11d染毒终点其含量并无显著变化；在两种实验条件下,小脑的GABA含量均未发生显著变化。4.中枢神经系统病理损伤及突触囊泡分布状态的变化4.1大脑皮层和小脑的病理损伤HE染色结果：ACR染毒可致大鼠大脑皮层神经元与周围组织间隙增宽,染色质嗜碱性增强；小脑浦肯野细胞形状不规则变化且与周围组织间隙明显增宽,伴有浦肯野细胞部分丢失。电镜结果：ACR亚急性染毒可致大鼠中枢神经系统神经元固缩、核膜凹陷；胶质细胞水肿；血脑屏障结构破坏；线粒体损伤；多聚核糖体解聚；粗面内质网和高尔基体扩张等。4.2突触数量的变化随ACR染毒浓度的增加,大鼠大脑皮层和小脑内突触数量逐渐降低。30mg/kg ACR染毒组与NS对照组相比,大鼠大脑皮层和小脑的突触数量显著降低(P0.05),50mg/kg ACR染毒组与对照组、30mg/kg ACR染毒组相比,大鼠大脑皮层和小脑的突触数量均显著降低(P0.05)。在ACR染毒终点,50mg/kg ACR染毒组与对照组相比,大脑皮层和小脑的突触数量降低幅度基本一致,均降低约50%。4.3大脑皮层和小脑突触囊泡分布状态的变化随ACR染毒浓度的增加,突触囊泡的分布变得分散,大脑皮层和小脑突触囊泡与突触活性区的最近距离(active zone distance, AZD)、突触囊泡间的最短距离(nearest neighbor distance. NND)均呈增加趋势,30mg/kg ACR染毒组与NS对照组比较NND显著增加(P0.01),50mg/kg ACR染毒组与NS对照组、30mg/kg ACR染毒组比较AZD. NND均显著增加(P0.01)。ACR染毒可改变大鼠中枢神经系统突触前部突触囊泡在易释放池(readily releasable pool, RRP)和储存池(reserve pool, RP)的分布比例,对NS对照组、30mg/kg ACR染毒组、50mg/kg ACR染毒组大脑皮层和小脑RRP、RP囊泡分布比例分别进行两两比较均有统计学差异(P0.01)；趋势性检验结果表明大脑皮层和小脑RRP囊泡比例随ACR染毒浓度增加而减少,RP囊泡比例随ACR染毒浓度增加而增加(P0.01)。5. Synapsin I、P-Synapsin I在中枢神经系统的组织定位免疫组化法结果表明,大鼠大脑皮层的Synapsin I和P-Synapsin I免疫反应产物均为棕色颗粒且分布位置一致：可见阳性颗粒围绕在神经元周围,衬托出神经元胞体的轮廓；大鼠小脑的Synapsin I和P-Synapsin I免疫反应产物均为棕色颗粒且分布位置一致：在浦肯野细胞层,深染的颗粒样物质围绕在浦肯野细胞周围,呈脉络状向分子层延伸,衬托出树突分支的轮廓,颗粒层也可见免疫阳性产物的分布。6.ACR染毒对大鼠大脑皮层和小脑Synapsin I、P-Synapsin I、BDNF蛋白表达的影响随ACR染毒浓度的增加,大鼠大脑皮层和小脑内Synapsin I、P-Synapsin I的含量均逐渐降低。30mg/kg ACR染毒组与NS对照组相比,大鼠大脑皮层和小脑的Synapsin I、P-Synapsin I含量显著降低(P0.05),50mg/kg ACR染毒组与对照组、30mg/kg ACR染毒组相比,大鼠大脑皮层和小脑的Synapsin I、P-SynapsinⅠ含量均降低显著(P0.05)。在ACR染毒终点,50mg/kg ACR染毒组与对照组相比,大脑皮层和小脑的Synapsin I含量降低幅度基本一致,均降低约50%。ACR染毒可致大鼠大脑皮层和小脑内BDNF的含量增加,30mg/kg ACR染毒组、50mg/kg ACR染毒组与NS对照组相比,大鼠大脑皮层和小脑的BDNF含量均显著增加(P0.05)。结论1.大脑皮层和小脑兴奋性和抑制性神经递质(Glu/GABA)的测试结果表明,ACR亚急性染毒致大鼠大脑皮层和小脑内兴奋性神经递质Glu含量的降低具有变化趋势的一致性和重现性,可能为其神经毒性的致病机制之一；ACR可能主要通过下调兴奋性神经递质水平,降低兴奋性/抑制性神经递质的比重而发挥神经毒作用；2.ACR亚急性染毒可致大鼠中枢神经系统神经元结构破坏、胶质细胞水肿、血脑屏障结构破坏、线粒体损伤、多聚核糖体解聚、粗面内质网和高尔基体扩张等,还可减少大鼠中枢神经系统的突触数量,改变突触前部突触囊泡的分布状态,增加大脑皮层和小脑AZD、NND,降低RRP囊泡分布比例,从而影响大鼠中枢神经系统神经递质的正常释放,造成相应的神经功能障碍；3.ACR亚急性染毒可降低大脑皮层和小脑Synapsin I、P-Synapsin I的蛋白表达量,可能是导致AZD增加、NND增加、RRP囊泡分布比例降低的原因；ACR亚急性染毒可短时增加BDNF的蛋白表达水平以增强中枢神经系统的抗损伤能力,起到一定的保护作用。
【关键词】：丙烯酰胺 谷氨酸 γ-氨基丁酸 突触素Ⅰ 突触囊泡
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要6-11
• Abstract11-15
• 前言15-18
• 英文缩写词表18-19
• 第一章 丙烯酰胺亚急性染毒对大鼠中枢神经系统谷氨酸、γ-氨基丁酸神经递质含量的影响19-32
• 引言19
• 材料与方法19-23
• 1. 主要仪器和试剂19-20
• 2. 实验动物20
• 3. 试剂配制20-21
• 4. 实验方法21-23
• 5. 统计学方法23
• 结果23-29
• 1. 体重变化23-24
• 2. 神经行为学变化24-25
• 3. 大脑皮层和小脑Glu和GABA含量变化25-29
• 讨论29-31
• 小结31-32
• 第二章 丙烯酰胺亚急性染毒对大鼠中枢神经系统病理损伤及突触囊泡分布状态的影响32-56
• 引言32-33
• 材料与方法33-38
• 1. 主要仪器和试剂33-34
• 2. 实验动物34
• 3. 试剂配制34
• 4. 实验方法34-38
• 5 统计学方法38
• 结果38-53
• 1. 大脑皮层和小脑的病理损伤38-42
• 2. 突触数量变化42
• 3. 突触囊泡分布状态变化42-53
• 讨论53-55
• 小结55-56
• 第三章 丙烯酰胺亚急性染毒对大鼠中枢神经系统突触素Ⅰ、磷酸化突触素Ⅰ、脑源性神经营养因子表达的影响56-70
• 引言56-57
• 材料与方法57-64
• 1. 主要仪器和试剂57-58
• 2. 实验动物58
• 3. 试剂配制58-59
• 4. 实验方法59-63
• 5. 统计学方法63-64
• 结果64-68
• 1. 大鼠大脑皮层和小脑Synapsin Ⅰ、P-Synapsin Ⅰ的分布位置64
• 2. ACR染毒对大鼠大脑皮层Synapsin Ⅰ、P-Synapsin Ⅰ、BDNF蛋白表达影响64-66
• 3. ACR染毒对大鼠小脑Synapsin Ⅰ、P-Synapsin Ⅰ、BDNF蛋白表达影响66-68
• 讨论68-69
• 小结69-70
• 总结70-72
• 参考文献72-75
• 致谢75-76
• 攻读学位期间发表论文76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 郭雄雄;严汉英;朱兰兰;曾立爱;熊飞严红;;丙烯酰胺对大鼠神经行为和黑质纹状体多巴胺及其代谢产物含量的影响[J];卫生研究;2011年04期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 肖经纬;丙烯酰胺神经损伤的突触素I靶点效应机制及脑源性神经营养因子的干预研究[D];中国疾病预防控制中心;2013年

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本文编号：933304