胆红素致神经细胞损伤及全基因组DNA甲基化水平变化的实验研究

发布时间：2017-10-08 00:24

  本文关键词：胆红素致神经细胞损伤及全基因组DNA甲基化水平变化的实验研究

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【摘要】：目的采用原代神经细胞培养技术,建立胆红素神经毒性模型,通过检测神经细胞结构损伤、细胞活力、细胞内钙离子稳态变化和细胞凋亡等观测终点,进一步探讨胆红素所致神经毒性损害的特征,初步探讨胆红素染毒神经细胞全基因组DNA甲基化水平的变化,为进一步探究高胆红素血症致神经损伤的表观遗传学机制提供依据。方法(1)选取健康SD大鼠新生鼠(24h以内),体外原代培养皮质神经细胞,选用Neurobasal无血清培养基(Invitrogen,美国)在37℃,5%CO2湿润恒温培养箱中培养细胞,并利用NSE免疫荧光法鉴定细胞种类；(2)培养3d的细胞(D3)经胆红素25、50、100μM处理4、12、24、48h后,通过MTT法检测胆红素染毒后的细胞活力；(3)通过HE染色观察细胞病理结构变化；(4)利用Hoechst33342进行荧光标记,通过荧光显微镜观察胆红素诱导的细胞凋亡情况；(5)利用Fluo-3荧光探针进行标记,通过荧光显微镜检测细胞内Ca2+浓度变化；(6)使用Caspase-3活性检测试剂盒(碧云天生物技术公司,中国)检测细胞内Caspase-3活性变化；(7)使用大鼠总Tau蛋白酶联免疫检疫试剂盒(上海CrystalDay Biotech公司,中国)检测细胞内总Tau蛋白表达量的变化；(8)经胆红素系列浓度(0、25、50和100μM)处理24h后,利用免疫荧光法检测细胞全基因组DNA甲基化水平。结果(1)采用原代神经细胞无血清培养技术,建立了胆红素神经毒性模型；经NSE免疫荧光检测,确定细胞为神经细胞；(2)神经细胞经胆红素染毒后,胞体减小,细胞核固缩,神经突变细、缩短,神经节点减少,细胞间连接稀疏；(3)MTT试验结果显示,随着染毒剂量增加,细胞活力下降,呈剂量-效应关系；同时,胆红素诱导的细胞活力下降也显示了明显的时间依赖性。(4)胆红素会导致细胞凋亡率增加,细胞核发生偏集、固缩和碎裂。随着染毒剂量的增加和染毒时间的增长,细胞凋亡率明显上升；(5)胆红素破坏细胞内Ca2+稳态,导致细胞内Ca2+富集。实验结果显示细胞内的浓度呈明显的剂量和时间依赖性。(6)胆红素会导致细胞内Caspase-3活性增加。随着染毒剂量增加或染毒时间的增长,Caspase-3的活性显著性增加；(7)胆红素会引起细胞内总Tau蛋白含量的改变。随着染毒剂量的增加,细胞内总Tau蛋白含量上升；染毒12h后,细胞内总Tau蛋白含量开始出现明显变化(F3,20=13.391,p=0.002),当染毒时间达到48h时,Tau蛋白含量开始下降(F3,20=13.313,p=0.002)；(8)胆红素会引起细胞表观遗传学上的变化。在染毒24h后,实验组的全基因组DNA甲基化水平较对照组明显上升(F3,28=11.218,p=0.001)。结论(1)胆红素会导致神经细胞病理学改变,神经细胞活力下降,凋亡率上升等神经毒性反应。(2)胆红素会破坏细胞内Ca2+稳态,并提高Caspase-3活性。另外,胆红素会导致神经细胞细胞内总Tau蛋白含量的上升,这可能与胆红素诱导的神经细胞微管结构破坏有关。(3)在本实验研究条件下,胆红素可提高全基因组DNA甲基化水平,为进一步研究高胆红素血症致神经损伤的表观遗传学机制提供了依据。
【关键词】：胆红素 神经细胞 原代培养 神经毒性 DNA甲基化 总Tau蛋白
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-14
• 1.1 胆红素与高胆红素血症10
• 1.2 高胆红素血症的表现10-11
• 1.3 高胆红素血症的神经毒性11-13
• 1.4 表观遗传学与发育神经学13
• 1.5 研究的目的、意义13-14
• 2 材料与方法14-25
• 2.1 材料和仪器14-17
• 2.1.1 实验动物14
• 2.1.2 主要试剂14-15
• 2.1.3 主要仪器15-16
• 2.1.4 溶液配制16-17
• 2.2 实验方法17-24
• 2.2.1 大鼠皮质神经细胞原代培养17-18
• 2.2.2 神经细胞鉴定18
• 2.2.3 细胞染毒18
• 2.2.4 细胞病理学观察18-19
• 2.2.5 细胞活力MTT法检测19
• 2.2.6 细胞凋亡检测19-20
• 2.2.7 细胞内钙离子检测20
• 2.2.8 蛋白定量20-21
• 2.2.9 Caspase-3活性检测21-22
• 2.2.10 细胞内总Tau含量检测22-23
• 2.2.11 DNA甲基化检测23-24
• 2.3 实验技术路线图24
• 2.4 统计处理24-25
• 3 结果25-35
• 3.1 原代培养神经细胞的鉴定25
• 3.2 胆红素对神经细胞活力的影响25-26
• 3.3 胆红素导致的神经细胞形态改变26-27
• 3.4 胆红素诱导神经细胞凋亡率增加27-29
• 3.5 胆红素导致神经细胞Caspase-3活性增强29-30
• 3.6 胆红素破坏细胞内Ca2+稳态30-31
• 3.7 胆红素对神经细胞总Tau表达的影响31-32
• 3.8 胆红素对DNA甲基化的影响32-35
• 4 讨论35-41
• 4.1 胆红素体外模型建立方法35-36
• 4.1.1 神经细胞的培养35-36
• 4.1.2 神经细胞染毒36
• 4.2 胆红素对神经细胞的损伤36-41
• 4.2.1 胆红素导致神经细胞活力下降36-37
• 4.2.2 病理学改变37
• 4.2.3 胆红素通过诱导神经细胞凋亡37-38
• 4.2.4 胆红素破坏神经细胞微管稳定性38-39
• 4.2.5 胆红素影响神经细胞全基因组DNA甲基化水平39-41
• 5 结论41-42
• 参考文献42-48
• 在学期间研究成果48-49
• 致谢49

【参考文献】

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1 王天成;贾光;王起恩;张金华;韩春华;程有全;沈惠麒;;胆红素拮抗间二硝基苯致大鼠肝细胞DNA氧化损伤作用[J];环境与职业医学;2006年05期

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本文编号：990953