慢性乙醇暴露经钠钙交换体诱导神经细胞凋亡的机制研究

发布时间：2020-05-12 18:45

【摘要】：目的:在世界范围内,饮酒是人们一种普遍的社会行为。人们因饮酒给国家、社会、家庭及个人带来的沉重的经济负担和社会危害。特别是饮酒会对人的生命健康构成非常严重的威胁。WHO发布的2018年饮酒和健康报告(《Global status report on alcohol and health 2018》)指出每年约300万人死于饮酒,占全球所有死亡人数的5.3%。在法医鉴定中,因饮酒引起的急、慢性中毒和死亡以及与饮酒相关的案例占有相当比例。越来越多的研究表明,许多疾病,特别是神经系统疾病发生发展,都与饮酒相关。尽管如此,涉酒人群依然庞大,同时越来越趋向年轻化,酒对人类的威胁日趋严重。作为饮用酒水中的主要成分,乙醇(ethanol,EtOH),俗称酒精,属一种有机化合物,能够透过血脑屏障(blood brain barrier,BBB),直接作用于脑神经细胞。长期慢性乙醇中毒引起神经损害,导致韦尼克脑病(Wernicke脑病)、柯萨科夫综合征(Korsakoff综合征)、慢性酒精中毒性痴呆、酒精性精神和行为障碍等,其中以认知功能障碍最为广泛。乙醇的确切毒理学机制还不是完全清楚。乙醇通过许多机制诱导神经细胞的退化及凋亡,其中细胞内Ca~(2+)超载诱导细胞凋亡是特别重要的一条通路,也是多种机制最终汇集的共同途径。细胞内Ca~(2+)超载将激活钙敏感蛋白,包括如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)和钙蛋白酶1(calpain-1)凋亡相关因子,启动细胞凋亡程序。另外,过量的Ca~(2+)还能影响线粒体ATP合成,破坏DNA结构。钙离子是机体内的重要离子,它对维持细胞内外离子浓度、信号转导、神经递质释放、突触可塑性以及学习和记忆方面具有十分重要的意义。通常细胞内游离Ca~(2+)浓度很低,约10~(-7)~10~-88 mol/L;细胞间液Ca~(2+)浓度较高,约5×10~(-3) mol/L。胞外的Ca~(2+)即使很少量涌入胞内都会引起胞质游离Ca~(2+)浓度显著变化,导致一系列生理反应。为维持细胞内外的Ca~(2+)浓度平衡,细胞会把完成“信使”任务的Ca~(2+)通过质膜上的钙泵(calcium pump,PMCA)和钠钙交换体(Na~+/Ca~(2+)exchanger,NCX)排出细胞。钙泵是一种质膜单向钙离子转运体,特点是与Ca~(2+)的亲和力强,转运力较弱,主要负责在静息状态下发挥作用。与钙泵不同,质膜NCX对Ca~(2+)浓度变化非常敏感,它有九个跨膜转运体,对Ca~(2+)转运力非常高,是钙泵的10-50倍。目前,在哺乳动物身上共发现了3个亚型NCX1、NCX2和NCX3。NCX1广泛表达在各个组织中,而NCX2和3只在脑和骨骼肌中表达。在脑中,NCX的三种亚型均有不同程度的分布和表达。NCX在细胞内Ca~(2+)突然升高(达500 mM以上)时激活,启动Ca~(2+)转运模式,把细胞内2/3以上的Ca~(2+)排出,NCX对神经细胞兴奋后Ca~(2+)大幅上升后迅速降低到基础水平起着特别重要的作用。慢性乙醇暴露能引起人和动物认知功能障碍,神经细胞胞质内Ca~(2+)超载导致细胞退化和凋亡是其病理基础。但是,为什么神经细胞质膜NCX不能通过排出Ca~(2+)阻止乙醇诱导胞质内Ca~(2+)超载还未见相关的研究报道,也未见乙醇暴露后是否能够引起NCX表达改变的研究。我们推测有可能是乙醇的促Ca~(2+)内流速度大于NCX的排钙速度,或者是乙醇通过某些机制抑制了NCX的表达使其不能充分发挥作用。针对慢性乙醇暴露诱导神经细胞凋亡过程中NCX的表达变化和功能异常的问题,本实验采用动物实验模型,观察慢性乙醇暴露对实验动物小鼠认知功能的影响、海马神经细胞的改变、NCX亚型表达变化以及它们之间的关联性;同时,采用细胞模型,观察乙醇暴露诱导神经细胞NCX1、NCX2和NCX3的表达变化情况,分析NCX亚型在慢性乙醇诱导的神经细胞凋亡中的作用,探讨慢性乙醇暴露诱导神经细胞凋亡的新的毒理学机制,也为慢性酒精中毒引起神经损害的防治提供基础数据和新途径,为法医学鉴定提供实验资料。研究方法:慢性乙醇暴露动物实验,采用C57BL/6雄性小鼠,分为30 d-CON组、30 d-10%EtOH组、30 d-20%EtOH组,60 d-CON组、60 d-10%EtOH组、60 d-20%EtOH组、90 d-CON组、90 d-10%EtOH组、90 d-20%EtOH组,每组10只。通过水迷宫观察不同组小鼠的学习记忆障碍情况。至预设时间,称重,乙醚麻醉后断颈椎处死小鼠,取脑组织,应用免疫组化观察小鼠海马中NCX亚型的分布和表达情况,应用western blotting和qPCR观察小鼠海马中NCX1、NCX2、NCX3以及calpain-1,cleaved-caspase 3的表达、Akt的磷酸化水平和CREB1的表达,分析NCX亚型的变化规律与慢性乙醇暴露后小鼠学习记忆障碍之间的关系。细胞实验:乙醇组:1 d-CON、1 d-100 mM、1 d-200 mM、2 d-CON、2 d-100 mM、2 d-200 mM;以及在乙醇组基础上加入LY294002、NaCl和分别沉默NCX1、NCX2和NCX3以后的对应分组。应用western blotting,观察乙醇暴露不同时间NCX1、NCX2、NCX3、calpain1、caspase3、Akt、p-Akt、CREB1的表达变化,分析与乙醇暴露的关系;通过抑制Akt磷酸化通路观察NCX亚型的变化以及对乙醇暴露诱导的神经细胞凋亡的影响。利用siRNA技术分别沉默NCX1、NCX2、NCX3亚型后,观察乙醇暴露后的神经细胞凋亡情况,明确三种亚型分别在慢性乙醇暴露时具体发挥的作用。对发挥主要作用的NCX亚型进行过表达,观察其对乙醇暴露诱导的神经细胞凋亡的影响,从正反两方面证实其作用。研究结果:动物实验:慢性乙醇暴露后小鼠的空间记忆能力随着暴露时间的延长和乙醇浓度的加大而损害严重。小鼠海马神经细胞中凋亡相关因子cleaved-caspase 3和calpain-1的表达随乙醇暴露的时间延长和剂量增加而增加。小鼠海马神经细胞中NCX三种亚型均有表达。短时间乙醇暴露使NCX1的表达上调,10%EtOH组上调明显,在60 d和90 d EtOH组,NCX1的表达与CON组之间无显著差异。NCX2的表达在乙醇暴露30 d时随浓度上升而上调,乙醇暴露60 d、90 d时,NCX2的表达与CON组之间无显著差异;NCX3的表达具有明显的规律性,在乙醇暴露30d时,10%EtOH组表达水平最高,CON组和20%EtOH组没有显著区别。随着暴露时间的延长和乙醇浓度是提高,NCX3的水平出现明显的下调;NCX3免疫组化染色见30 d组10%EtOH组小鼠海马的CA1、CA3和DG区的NCX3阳性表达较高,20%EtOH组内NCX3的阳性细胞数相比CON组明显减少。乙醇暴露60-90 d,小鼠海马的CA1、CA3和DG区NCX3阳性细胞数和强度随时间和剂量显著下调,细胞出现凋亡,以CA3区的改变严重。NCX3上游的Akt磷酸化水平和CREB1的水平与NCX3的表达趋势一致。细胞实验表明乙醇暴露促进了细胞内Ca~(2+)的上升和细胞凋亡的增加,凋亡相关因子caspase 3和calpain-1表达增强;高浓度乙醇对NCX1的表达先促进后抑制,低浓度乙醇对NCX1具有缓慢促表达作用。随着乙醇浓度的增加和暴露时间的延长,NCX2的表达逐渐增强;NCX3也是随着乙醇浓度的增加和暴露时间的延长而表达增强。Akt的磷酸化程度在乙醇暴露1 d时随浓度增加而增强,在2 d时明显回落。当用LY294002抑制Akt的磷酸化途径后,NCX1和NCX3的表达降低,乙醇的促细胞凋亡作用增强,细胞内的Ca~(2+)超载严重。利用siNCX分别下调了NCX1、NCX2和NCX3的水平,结果发现NCX1对短时间暴露在乙醇环境下的神经细胞有保护作用,对长期暴露效果差;下调NCX2可能因为代偿性上调了NCX3水平而达到保护神经细胞的效果。沉默NCX3直接导致暴露在乙醇环境下的神经细胞内的Ca~(2+)荧光信号明显增强,凋亡因子cleaved-caspase 3和calpain-1的表达显著上调,细胞凋亡率增加。当过表达NCX3后,发现暴露在乙醇中的神经细胞的凋亡程度明显降低。提高暴露在乙醇环境下神经细胞培养基中的Na~+浓度,神经细胞的凋亡程度明显减轻,其机制是通过上调NCX3的表达所实现,当下调NCX3水平后,提高细胞外Na~+浓度不能起到保护神经细胞的作用。结论:1、慢性乙醇暴露导致小鼠的空间学习和记忆能力障碍;2、慢性乙醇暴露引起小鼠海马神经细胞NCX3表达降低与小鼠学习记忆障碍有关;3、慢性乙醇暴露可引起小鼠海马各区神经细胞损伤,以CA3区神经细胞受损最为严重;4、NCX3蛋白表达变化有望为慢性乙醇中毒引起神经损害的病理学诊断提供参考;5、NCX3表达增强能抑制慢性乙醇暴露诱导神经细胞凋亡,提高细胞外钠离子浓度有望作为乙醇引起的神经细胞损害的治疗靶点。
【图文】：

水迷宫,小鼠

图 1. 水迷宫逃避潜伏期实验A: 逃避潜伏期 30 d：10% EtOH 和 20% EtOH 组小鼠寻找平台的平均耗时要高于 CON 组。实验第 3 天和第 4 天 20% EtOH 组与 CON 组有显著差异（*P<0.05）；20% EtOH 组的平均耗时高 10% EtOH 组；B: 逃避潜伏期 60 d：CON 组小鼠在 1-4 天比较中，耗时越来越少；EtOH 组小鼠所需时间高于 CON 组，在第 2 天 20% EtOH 组和第 4 天的 10% EtOH 组、20% EtOH 组用时显著多于 CON组（*P<0.05，**P<0.01）；C: 隐蔽平台 90 d：在第 1-4 天的乙醇暴露组与 CON 组的小鼠寻找平台所需时间均存在显著差异（*P<0.05，**P<0.01）；第 2 天和第 3 天 20% EtOH 组与 10% EtOH 之间有显著差异（#P<0.05）。同时，20% EtOH 组显著低于 10% EtOH 组（#P<0.05）；在乙醇暴露 90 d 时，10%EtOH 组和 20% EtOH 组之间的小鼠空间探索次数没有显著差异，但与 CON 组比较进一步下降（**P<0.01）。采用单因素方差分析，，*P <0.05和**P <0.01同CON组相比，#P <0.05同10%EtOH相比。

轨迹图,空间探索,小鼠,水迷宫

图 2. 水迷宫空间探索A：不同处理条件下小鼠在 60 秒内穿越平台区的轨迹图。B:各组小鼠空间探索次数统计。30 d、60 d 和 90 d EtOH 处理组的小鼠随着乙醇浓度的升高穿越平台次数逐渐减少（*P <0.05，**P<0.01）；在乙醇暴露 30 d 和 60 d 时，小鼠穿越平台的次数与乙醇浓度呈负相关，20% EtOH 与 10% EtOH 之间有显著差异（#P<0.05）。采用单因素方差分析，*P <0.05 和**P <0.01 同 CON 组相比，#P <0.05 同 10%EtOH 相比。3.3 慢性乙醇暴露诱导小鼠海马组织calpain-1和cleaved-caspase 3的表达上调慢性乙醇暴露 30 d，小鼠海马组织内凋亡相关因子 calpain-1 和 cleaved-caspase3 的表达上调。（图 3.A）乙醇暴露 30 d 的 calpain-1 蛋白的 10% EtOH 和 20% EtOH组比 CON 组上调幅度分别为 198.5%和 354.5%。乙醇暴露 60 d，calpain-1 的表达更
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：D919.4

【参考文献】