骨骼肌circRNA在法医学死亡时间推断中的初步筛选及验证研究

发布时间：2020-05-27 11:02

【摘要】：目的死亡时间(postmortem interval,PMI)的精确推断一直是法医学中的重点和难点,但是到目前为止还没有得到统一的检测方法和指标。本研究通过构建骨骼肌中环状RNA(circular RNA,circ RNA)表达谱,筛选出人体骨骼肌中与死亡时间具有时序性变化的circ RNAs,并进一步对筛选出的circ RNAs进行验证,然后探讨其相对表达量与死亡时间的相关性,为法医学中对死亡时间推断提供一个新的思路及指标。方法(1)芯片实验:(1)选取2例外界温度、湿度相对一致,已知死亡时间在24 h以内的个体,取其右侧第三、四肋间肌组织,放置在PBS缓冲液中于温度为18℃,湿度为50%的人工气候箱中模拟自然降解过程;(2)分别于尸检即刻(0天)、3天、5天、7天、10天各取50 g组织放入液氮中冻存,然后进行总RNA的提取;(3)对提取的RNA进行质检,质检合格后,进行逆转录、探针标记、基因芯片检测等实验,最终得到circ RNA表达谱。(2)circ RNAs的筛选及验证:(1)将后续收集到的与之前外界温度、湿度相对一致的18例死亡个体的肋间肌检材放置在相同条件的人工气候箱中;(2)分别于死亡1-10天定时取适量组织进行RNA提取、逆转录,然后将所得c DNA放置在-80℃冰箱,以便后续实验的进行;(3)根据Norm Finder软件筛选GAPDH、β-Actin、mir133a-3p三者中最稳定的内参基因;(4)根据所得的circ RNA表达谱筛选与死亡0天具有显著差异的circ RNA,并去除分子量过大或过小以及表达量较低的circ RNAs;(5)对筛选出的circ RNAs在文献中查找其已经验证过的引物序列,如有相同circ RNA,则直接利用其序列;若未找到相关文献报道,则利用circbase查找其基因序列,并用primer-blast进行引物设计;(6)用上述所得c DNA对所筛选出的circ RNAs进行Q-PCR实验,在18例检材中验证它们的相对表达量与死亡时间的相关性。(3)统计分析:利用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析。结果骨骼肌组织中共检测出13156个circRNAs,通过与死亡0天的circRNAs的相对表达量相比,具有明显下降趋势的circ RNAs在第三天共有353个,第5天共有259个,第7天共有273个,第10天共有290个,且均为P0.05,Fold change2。但在10天内整体呈下降趋势的circ RNAs只有hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0001946、hsa_circ_0001971等7个。根据Norm Finder软件对内参基因的筛选,发现mir133a-3p在本实验中最稳定。对所筛选出的7个circ RNAs在18例检材中进行验证,发现只有hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0001871等5个circ RNAs随着死亡时间的增加,其相对表达量显著下降,且具有统计学意义(P0.05)。而hsa_circ_0001946、hsa_circ_0001971等2个circ RNAs的表达为阴性。结论(1)肌肉组织可作为测定中晚期死亡时间的候选组织(2)mir133a-3p在本实验中为最稳定的内参基因。(3)经验证发现hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0001871等5个基因随着死亡时间增加,其相对表达量显著降低。(4)circ RNA可作为一种较为稳定的生物标记物用于死亡时间推断的研究。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：D919

【参考文献】