辐射致癌miRNA-mRNA网络分析及新关键分子miR-486功能研究

发布时间：2020-06-27 06:59

【摘要】：研究背景核能与核技术已广泛应用于工业、国防和医疗等领域。但是核事故、核泄漏等带来的电离辐射损伤相关医学问题一直是公众关注的问题,不少方面还未找到很好的解决办法。辐射致癌就是其中之一,它是电离辐射导致的远期效应,发生机制不明,早期监测、早期干预和特异性治疗手段都非常有限,众多难题尚未研究解决,亟需从新的途径不断探索辐射致癌的分子机制,寻找新的靶向分子,为早期监测、早期干预和特异性的治疗提供新理论、新思路。miRNA在生物体的发育、增殖、分化、凋亡、免疫反应、肿瘤发生等方面的作用已有诸多报道,但在辐射致癌中的作用却关注较少。为此,我们课题组在前期开展了辐射致癌与miRNA关系的研究,并首次报道了数条miRNA的作用,如miR-100,miR-467a,miR-200c和miR-21等,为miRNA与辐射致癌的研究提供了有益的借鉴。但是,随着研究的深入,发现仍然存在许多重要的问题没有解决,包括:1、辐射致癌中的关键miRNA仍未确认;2、单个miRNA的改变已很难完全解释辐射致癌的发生机制,亟需从新的角度来阐述疾病的发生过程。这些难题的出现,一方面是因为生命活动的复杂性,另一方面也由于过去研究方法和实验技术的局限性。对于miRNA而言,其主要是通过靶向目的基因的mRNA起作用,因此,构建miRNA-mRNA调控的网络已成为近年来miRNA研究邻域的一个重要热点。Darnell,R.B等在2009的Nature杂志首先报道并提出了miRNA-mRNA网络图(miRNA-mRNA interaction maps)概念。随后,许多科学家利用miRNA-mRNA网络,开始从整体和“模块”的角度研究肿瘤的特征,并发现了多个重要的新靶点,为肿瘤研究开辟了新的道路。这种基于miRNA筛选构建miRNA-mRNA网络的方法具有两个重要的特征:1、以miRNA及其靶向的众多mRNA作为一个“模块”去描述其对疾病发生、发展的影响,符合现代科学研究的“整体观”,具有较高的科学性;2、从网络的全局,我们更容易看到各miRNA调控的mRNA数量和功能,因此也更直观和容易筛选出起关键作用的miRNA,从而为疾病防治靶点的研究提供关键线索。为此,我们率先在国际上开展辐射致癌“miRNA-mRNA网络”研究,并基于该网络筛选出了miR-486作为辐射致癌中的关键miRNA做进一步的生物学研究。从动物、细胞水平验证miR-486对肿瘤细胞的作用及对辐射致癌的影响,并确认了其靶向的mRNA和结合位点,在此基础上进一步研究其下游的分子通路,为辐射致癌新靶点的研究提供了新思路。主要研究内容和实验结果1、获取辐射致癌相关的miRNA表达谱和基因表达谱利用多次小剂量γ射线照射建立辐射诱导胸腺淋巴瘤模型,提取三样本重复的辐射诱导胸腺淋巴瘤组织及正常对照组织来源的总RNA,通过Affymetrix miRNA Array和mRNA Array方法,发现辐射致癌组织与正常组织miRNA总体表达谱有显著的差异,筛选出63条差异表达miRNA。结合miRNA芯片和Real Time-PCR验证等实验,发现与正常胸腺组织相比较,辐射诱导小鼠T淋巴瘤组织中明确上调的miRNA有15条,分别是miR-762,miR-714,miR-467a,miR-455,miR-699,miR-712,miR-685,miR-705,miR-494,miR-711,miR-181d,miR-149,miR-720,miR-744,miR-210等;而辐射致癌组织中下调最明确的miRNA有11条,分别是miR-145,miR-376b,miR-708,miR-152,miR-143,miR-200c,miR-193b,miR-203,miR-100,miR-99a,miR-486。发现和验证的26条辐射致癌组织差异表达的miRNA,可为后续研究提供重要线索。2、构建与辐射诱导的小鼠胸腺T淋巴瘤相关的差异信号通路图和关联网络图通过GO富集分析、KEGG通路分析及生物信息学分析,共得到辐射诱导的小鼠胸腺T淋巴瘤相关的283个信号通路差异图,找出了最具代表性的几条通路,其中五个可能在辐射致癌中发挥重要功能的的信号通路图,它们分别是:凋亡信号通路,细胞周期信通路,cytokine-cytokines receptor pathway,NF-κB信号通路和p53信号通路。经过对TargetScan、miRanda、PicTar、miRBase 4种预测方法、4个软件结果的汇总,最终得到1070个miRNA-mRNA潜在靶向关系;再通过对辐射致癌组织与正常胸腺组织mRNA表达谱分析,筛选到3160个差异基因,最后将两个结果进行匹配,共得到567个预测与芯片筛查结果一致的mRNA。进一步,我们通过MAS分析,首次成功构建了辐射诱导的小鼠胸腺T淋巴瘤相关的miRNA-mRNA关联网络图,有助于从miRNAmRNA网络层面揭示辐射诱导T淋巴瘤的分子机制,为辐射致癌的相关研究提供新的理论和实验依据。3、研究miRNA-486表达水平与小鼠T淋巴瘤之间的关系通过对小鼠胸腺T淋巴瘤相关miRNA-mRNA关联网络图的分析,筛选和锁定了一条处于miRNA-mRNA关联网络图HUB地位且在辐射致癌中未见报道的miRNA即miR-486进行深入研究。成功构建miRNA-486上调和下调细胞模型以及具有知识产权的miR-486 KO小鼠,体外实验通过表达和下调表达等实验体系,发现上调miR-486可以显著抑制小鼠T淋巴瘤细胞增殖及细胞活力,促进小鼠T淋巴瘤细胞凋亡。而下调miRNA-486则能明显提高细胞增殖活力,抑制小鼠T淋巴瘤细胞的凋亡。体内实验通过构建过表达miR-486的稳转细胞株进行裸鼠皮下荷瘤发现:过表达miR-486抑制肿瘤的生长。通过对miR-486敲除小鼠进行多次小剂量γ射线照射诱导辐射致癌发现:miR-486敲除小鼠的成瘤率明显升高,促进辐射致癌的发生。提示miR-486在辐射致癌中扮演重要角色。4、探索miR-486调控T淋巴瘤细胞的新靶点结合前期的基因表达谱结果,我们发现IGF2BP3在辐射诱导的小鼠胸腺T淋巴瘤中上调倍数最大,且与miR486靶点预测的结果相一致。因此,我们认为IGF2BP3很可能是miR-486调控T淋巴瘤细胞的重要靶点。进一步通过双荧光素酶报告基因检测发现:当与IGF2BP3的mRNA作用时,野生型组miR-486和Ad-miR-486的荧光素酶活性显著下降,miR-486 ASO的荧光素酶活性升高。突变型组荧光素酶活性却无明显变化。这说明miR-486主要通过3’UTR依赖的方式靶向作用于IGF2BP3。通过miRNA-mRNA相关性分析和萤光素酶实验等实验体系证实了miR-486调控T淋巴瘤细胞的一个新靶点即IGF2BP3,发现miR-486可有效抑制IGF2BP3蛋白和mRNA。利用功能回复实验发现IGF2BP3可以显著促进T淋巴瘤细胞恶性增殖并可以逆转miR-486对T淋巴瘤细胞的调控作用,从另一个方面再次证明了IGF2BP3是miR-486调控T淋巴瘤细胞的一个新靶点。5、阐明miR-486靶向IGF2BP3的关系及作用机制机制研究发现miR-486主要通过3’UTR依赖的方式靶向作用于IGF2BP3;进一步研究发现IGF2BP3的3-UTR区有两个miR-486的结合位点,即896-903位点及928-934位点,两个结合位点都对IGF2BP3被miR-486调控起作用,且896-903位点结合贡献可能略强于928-934位点与miR-486的结合。这些结果在辐射致癌早期监测、早期干预和特异治疗研究中具有潜在的应用价值。6、探索miR-486靶向IGF2BP3调控辐射致癌的机制免疫组化的结果显示过表达miR-486能够抑制IGF2BP3与IGF2的表达,而miR-486敲除促进IGF2BP3和IGF2的表达。同时Western Blot结果提示过表达miR-486可能通过IGF2BP3/IGF2/PI3K/AKT/mTOR的信号通路来发挥作用,通过抑制细胞周期相关蛋白D1,D3,CDK2,CDK4,CDK6,P21,P27等的表达来抑制增殖。下图是我们根据研究结果提出的miR-486调控辐射诱导小鼠T淋巴瘤的作用机理图。miR-486调控T淋巴瘤细胞功能可能主要通过一个重要下游新靶点IGF2BP3来实现的:即在miR-486正常表达水平情况下,可以有效抑制其靶点IGF2BP3,从而使IGF2BP3的表达水平维持在较低水平,有效抑制T淋巴瘤进展。反之,当miR-486表达水平下降时,可削弱对其靶点IGF2BP3的有效抑制,IGF2BP3表达增加,IGF2BP3表达增加可以显著促进T淋巴瘤细胞的恶性增殖并抑制T淋巴瘤细胞的凋亡。电离辐射可导致miR-486表达水平异常,表现为miR-486表达水平显著下降,由此导致因miR-486表达不足而不能有效地抑制其靶点IGF2BP3,使得IGF2BP3的表达水平显著增高并持续维持在较高水平,进而显著促进T淋巴瘤细胞的恶性增殖并抑制T淋巴瘤细胞的凋亡,最终表现为辐射诱导小鼠T淋巴瘤的发生发展。由此可见,miR-486的表达水平对小鼠T淋巴瘤的发生可能起到关键的作用。（？）讨论分析目前关于miRNA在肿瘤中的作用及其机制研究主要集中在一般的临床肿瘤,而在辐射致癌领域中的研究相对较少,在辐射致癌的分子机制问题上国内外至今仍有大量空白点,很多重要问题并不十分清楚。经国内外文献调研分析,有关辐射致癌中miRNA-mRNA关联分析的分子网络图构建工作目前尚未见报道,不少miRNA(例如miR-486等)在辐射致癌中的作用目前也未见报道。本课题组从国防和国家核能发展对医学防护的需求出发,深入研究辐射致癌的分子机制,并在miRNA研究领域发现数条与辐射致癌密切相关的miRNA。研究从理清众多miRNA在辐射致癌中的相互之间关系,筛选关键的miRNA并寻找新的靶向分子,阐明它们的具体功能和机制入手,利用miRNA芯片和基因芯片等多项先进的生物信息学研究技术,大规模分析了肿瘤组织和正常组织的表达谱差异,确定差异表达分子,然后利用生物信息学手段标注出这些差异表达的生物学意义,筛选出一批与辐射致癌相关的miRNA分子,获得重要分子miR-486及其靶向位点IGF2BP3。通过对实验结果的分析,可以发现辐射致癌组织中miRNA表达谱和基因表达谱会发生显著改变。以本研究辐射诱导胸腺淋巴瘤模型为例,共筛选出63条差异表达miRNA,其中上调最显著的有15条,下调最显著的有11条。在此基础上构建的辐射诱导的小鼠胸腺T淋巴瘤相关的283个信号通路差异图,显示它们的重要程度以及在辐射致癌中可能发挥的作用意义。构建的辐射诱导的小鼠胸腺T淋巴瘤miRNA-mRNA关联网络图更是有助于从miRNA-mRNA网络层面分析它们之间的复杂关系,为寻找关键分子提供新的线索和实验依据。幸运的是,本研究通过对小鼠胸腺T淋巴瘤相关miRNA-mRNA关联网络图的分析,筛选出一条处于miRNA-mRNA关联网络图HUB地位且在辐射致癌中未见报道的miRNA(即miR-486),通过一系列深入研究,发现它的表达水平与小鼠胸腺淋巴瘤细胞的增殖和凋亡等密切相关,而且这种效应主要通过3’UTR依赖的方式靶向作用于IGF2BP3实现的,强烈提示miR-486在辐射致癌中扮演重要角色。综上所述,本课题从miRNA-mRNA网络层面和关键分子的筛选方面为揭示辐射诱导T淋巴瘤的分子机制提供新的理论和实验依据;获得的新关键分子miR-486也可能在辐射致癌早期监测、早期干预和特异治疗研究中具有潜在应用价值。研究结果也可以为其它类型肿瘤的研究提供新思路、新靶点、新线索。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R818

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