同卵双生子DNA甲基化甄别体系法医学应用评估

发布时间：2020-08-08 10:44

【摘要】：目的:同卵双生子(monozygotic twins,MZT)的鉴别依然是法医学未解难题。本课题组对此进行系列研究,构建了一组包含9个序列37个CpG位点的DNA甲基化检测体系,对120对MZT进行研究,以MZT之间甲基化水平差值大于5%作为阈值,区分MZT个体的能力达到94.20%;以10%为阈值时,区分能力为55.33%。为进一步评价该体系的法医学实际应用价值,本课题对该体系进行灵敏度、稳定性、组织一致性、模拟法医实际检材等研究。方法:采集26对MZT(0~80岁)外周血,验证MZT的检测体系区分MZT个体的效能。采集20名健康成年无关个体不同时期外周血样本,采样间隔3个月,时间跨度9个月,共采样4次,验证时间稳定性。采取3例尸检个体的心脏、肝脏、肾脏、和脑组织样本,评价组织一致性。比较两个亚硫酸氢盐转化试剂盒的转化回收率,设置不同浓度转化后DNA进行灵敏度研究。取3名成年无关个体指尖血制备的血痕、口腔拭子及2根含毛囊的头发,评价检测体系对法医实际检材的应用价值。应用E.Z.N.A Blood DNA Midi kit(OMEGA Bio-Tek)提取血液样本的基因组DNA;应用QIAamp DNA Investigator Kit(Qiagen)试剂盒提取头发、口腔拭子、血卡和组织的基因组DNA。DNA经EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO)和EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(Qiagen)进行亚硫酸氢盐转化,以转化后的DNA为模板,扩增LINE-1、GS1、GS3、IGS1、IGS2、IGS3、IGS4、IGS5、IGS6九条靶序列,对扩增产物进行焦磷酸测序,获得9条序列37个CpG位点甲基化水平的定量数据。应用Excel、SPSS 24.0软件对实验结果进行统计分析。结果:在研究的132份血液样本中,LINE-1、GS1、GS3、IGS1、IGS2、IGS3、IGS、IGS5、IGS6序列的平均甲基化水平为61.68%、91.23%、91.45%、76.26%、75.45%、84.05%、80.86%、74.21%、82.52%。26对MZT测试样本的结果表明,在甲基化差异阈值为5%和10%的条件下,九条序列区分MZT的数量分别为22对(84.62%)和10对(38.46%),与前期研究中训练样本结果无统计学差异。时间稳定性结果表明,在20名成年无关个体时间跨度9个月间隔3个月的4个血液样本间,同一个体九条序列的甲基化程度均无明显差异,证实其在相对较短时间内具有稳定性。但比较一对MZT间隔7年的甲基化程度,发现只有基因区三条序列LINE-1,GS1和GS3的DNA甲基化程度未发生明显变化,而基因间区六条序列IGS1、IGS2、IGS3、IGS4、IGS5、IGS6都表现出随着时间的推移,DNA甲基化水平明显降低。组织一致性检测结果表明,在心、肝、肾和脑4种组织样本,LINE-1、IGS1、IGS5和IGS6序列未表现出DNA甲基化差异,但GS1、GS3、IGS2、IGS3和IGS4这五条序列甲基化程度存在明显差异。GS1序列在肝组织的DNA甲基化程度高于其它三种组织,IGS3序列在脑组织的DNA甲基化程度低于其它三种组织,DNA甲基化差值40%。灵敏度研究结果发现,EZ DNA Methylation-Gold Kit和EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit的平均转化回收率分别为74.24%和64.76%;序列LINE-1,GS1,GS3,IGS1和IGS2,在转化后DNA为5 ng时,可以得到可靠的结果,序列IGS3,IGS4,IGS5和IGS6在转化后DNA为10 ng时,可以得到可靠的结果。对法医模拟检材进行研究,发现血痕、口腔拭子和毛发三种检材均可检出九条靶序列的DNA甲基化水平,但GS1、IGS2、IGS4和IGS5这四条序列在三种检材的甲基化程度有明显差异。结论:对焦磷酸测序技术构建的九条序列DNA甲基化检测体系进行法医学应用评估,证实该体系对同卵双生子具有一定的区分能力;九条序列的甲基化在一年时间内具有相对稳定性,基因区序列在7年内也很稳定,但基因间区序列表现出明显差异;GS1、GS3、IGS2、IGS3和IGS4五条序列的DNA甲基化具有组织差异性,其余四条序列未表现出明显的组织差异性;对于血痕、口腔拭子和毛发三种常见法医检材,均可获得准确结果,检测的最低浓度在5 ng至10 ng之间变化,具体取决于序列。检测灵敏度可满足常量法医检材,具有一定的法医学应用价值。检测体系鉴别MZT的能力及灵敏度尚需进一步提高。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：D919.4
【图文】：

靶序列

17图 1 LINE-1 靶序列及其引物序列Fig.1 LINE-1 target sequence, bisulfite conversion sequence, primersequences and the target CpG sites. Sequences in gray box are PCR primers,sequence in yellow box is sequencing primer, sequences in blue box are thetarget CpG sites.

靶序列

图 2 GS1 靶序列及其引物序列Fig.2 GS1 target sequence, bisulfite conversion sequence, primer sequencesand the target CpG sites. Sequences in gray box are PCR primers, sequence inyellow box is sequencing primer, sequences in blue box are the target CpGsites.

靶序列

图 3 GS3 靶序列及其引物序列Fig.3 GS3 target sequence, bisulfite conversion sequence, primer sequenceand the target CpG sites. Sequences in gray box are PCR primers, sequence inyellow box is sequencing primer, sequences in blue box are the target CpGsites.

【参考文献】