S100A1蛋白对运动氧化应激损伤心肌线粒体功能的调控

发布时间：2020-09-16 09:53

　　人体进行力竭运动时,会产生大量氧自由基,导致心肌细胞损伤和线粒体功能紊乱。因此,研究运动氧化应激致心肌线粒体功能调控对预防运动性心肌损伤非常重要。S100A1是一种钙结合蛋白,具有提高心肌收缩力,调节血管功能,刺激ATP合成酶活性等作用,与腺苷酸转运蛋白(ANT)结合,影响线粒体的代谢及凋亡等。但运动氧化应激致心肌损伤后S100A1是否通过ANT调控心肌线粒体功能尚未见报道。本实验通过建立运动氧化应激损伤动物模型和离体心肌细胞氧化应激损伤模型,研究S100A1和ANT蛋白在心肌组织中的表达和线粒体的功能变化;采用外源性S100A1干预和敲除S100A1基因研究S100A1对氧化应激心肌线粒体功能的影响及调控,初步阐释其对氧化应激心肌线粒体功能调控机制,为建立运动性心肌损伤防护开辟新思路。主要研究结果如下:1、S100A1和ANT蛋白在不同大鼠心肌组织中的表达变化以雄性Wistar大鼠为实验对象,随机分为力竭运动损伤组(Exhaustion exercise injury,EI)和正常对照组(Normal Control,NC),对EI组进行为期10天的连续力竭运动训练。待训练结束以后,即刻取大鼠血液和心肌组织,分别进行生化和病理指标检测。结果表明:力竭运动后,ROS活性和CK活性显著高于对照组;SOD活性和GSH-PX含量显著低于对照组。提示,大鼠力竭运动会导致心肌细胞氧化应激损伤,机体抗氧化能力降低。HE结果表明,力竭运动会导致大鼠心肌组织呈现空泡变性、心肌间质水肿等病理变化。电镜发现,对照组心肌组织毛细血管通畅,心肌纤维排列整齐,线粒体结构致密,心肌间质无明显渗出。运动损伤后,大鼠心肌组织间质渗出明显,毛细血管扩张,部分心肌细胞破裂,线粒体轻度肿大,心肌纤维及嵴不同程度断裂,可见局灶性坏死。免疫组化显示,正常心肌组织中,S100A1和ANT蛋白均匀分布,而损伤心肌组织中S100A1和ANT蛋白明显减少。Western-Blot结果表明,与对照组相比,损伤心肌组织中的S100A1和ANT蛋白表达水平降低。2、S100A1蛋白对氧化应激损伤心肌线粒体功能的影响及调控采用大鼠H9c2心肌细胞为研究对象,以1 mM的H_2O_2干预12 h,成功建立大鼠H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型。结果表明,H_2O_2可诱导大鼠H9c2细胞发生氧化应激损伤,导致大鼠H9c2心肌细胞存活率降低,并伴有部分H9c2心肌细胞发生凋亡。外源性S100A1蛋白干预后,H9c2心肌细胞存活率升高。这提示,S100A1蛋白具有降低H9c2心肌细胞氧化应激损伤,抑制细胞凋亡的作用。RT-PCR结果表明,氧化应激损伤心肌细胞中S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam的mRNA含量显著降低,外源性S100A1蛋白干预后,ANT、PGC-1α、Tfam的mRNA含量显著升高。Western-Blot结果表明,氧化损伤后,心肌细胞S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam蛋白表达降低。S100A1蛋白干预后,心肌细胞S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam蛋白含量表达升高。为了研究S100A1对氧化应激损伤心肌线粒体功能的影响及调控,我们采用Si-RNAS100A1技术,使心肌细胞S100A1基因沉默,RT-PCR和Western-Blot结果显示,敲除S100A1后,心肌细胞S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam的基因和蛋白表达降低。提示,S100A1蛋白可能是通过与ANT的相互作用,进而影响PGC-1α及核转录因子Tfam的表达,发挥对损伤心肌线粒体功能的影响及调控作用。综上所述,力竭运动可致大鼠心肌细胞氧化应激损伤和线粒体功能紊乱,S100A1和ANT蛋白在力竭运动氧化应激损伤大鼠心肌组织中表达降低。建立了H9c2心肌细胞氧化应激模型,给予外源性S100A1蛋白后,H9c2心肌细胞存活率升高,同时ANT、PGC-1α和Tfam的基因和蛋白表达水平升高。敲除S100A1后,H9c2心肌细胞S100A1、ANT、PGC-1α和Tfam的基因和蛋白表达水平降低。提示,S100A1蛋白对氧化应激损伤心肌线粒体功能的影响及调控,可能是通过S100A1蛋白与线粒体靶标ANT相互作用,介导胞浆ADP和线粒体ATP的交换。ANT蛋白具有促进PGC-1α功能的作用。PGC-1α含量的升高,同时会伴有核转录因子Tfam的表达增加,进而促进线粒体功能改善,这可能是S100A1蛋白对氧化应激损伤心肌线粒体功能的调控机制之一。
【学位单位】：天津理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R87
【部分图文】：

示意图,蛋白结构,示意图

图 1.1 S100 蛋白结构示意图[29]Figure 1.1 The schematic diagram of the structure of S100 protein.2 S100A1 调节心肌细胞 Ca2+的平衡受损的肌质网（SR）钙稳态的出现成为了人类心力衰竭（HF）的重要标志。研现，当机体发生心力衰竭时，心脏中的 S100A1 表达水平降低，首先确认为 S100与心肌肌肉收缩。且 S100A1 可以同结合位点的结合物以微摩尔相互结合。NMR [19]显示该肽结合在 S100A1 的钙离子（Ca2+）依赖性疏水间隙内。S100A1 在骨骼肌收缩耦合中起主要作用，通过与兰诺定受体（RyR）的结构域的特异性相互作用进表明可以使用 S100A1 作为治疗心脏和骨骼肌病的潜在手段。在非心脏细胞类型和分离的 SR 囊泡中，S100A1/SERCA2a 共沉淀研究表明 S100 SERCA2a 的结合导致酶的活性增加，肌质网状（SR）Ca2+的摄取提高，（SR）C荷增强[23,24]。在 SERCA2a 含量减少的人的衰竭心肌细胞中，通过使用腺病毒载体转染的 S100

靶向,相互联系,心肌细胞,结构示意图

图 1.2 A S100A1 对心肌胞内 Ca2+的调节及相互联系；B 心肌细胞中 S100A1 靶向结构示意图[33]Figure 1.2 A The regulation and interrelation of S100A1 on the intracellular Ca2+in the myocardiumB The schematic diagram of the target structure of S100A1 in cardiac myocytes用 β-肾上腺素处理去除 Ca2+的细胞质和 SR 后，其细胞质 Ca2+和肌质网 Ca2+负荷强，表明 S100A1 不仅表现出部分 β-肾上腺素的功能，而且还具有提高部分 β-肾上腺的功能，增加 RyR2 舒张功能从而降低心律失常[26]。这说明 S100A1 最有可能在 cAM依赖性蛋白激酶 A 和 Ca2+/CaM 钙调素依赖性蛋白激酶 II 的下游独立作用[27]。为了阐明 S100A1 在心脏和骨骼肌中的功能，多个研究已经证明去除 S100A1 之后由于受到功能性受损的兰诺定受体（RyR）的影响导致了肌细胞的分裂减少。通过测肌质网囊泡和色氨酸荧光实验，还确定完整的兰诺定受体的细胞质上有一个与 S100A新的结合位点，并对应于确定的钙调蛋白结合位点。S100A1 与兰诺定受体（RyR）磷蛋白/肌质网（SR）Ca2+-ATPase 复合物相互作用，并且可能通过与这些蛋白质的相作用调节 Ca2+循环，导致更快和更稳定的肌细胞收缩。RyR2 属于 RyR 基因家族中的一种，集中分布在心肌细胞质膜且靠近于 T 管的内部部位，在空间结构上和 L 型 Ca2+通道紧密相连的 Ca2+释放通道受体[28]。

示意图,内皮细胞,示意图,小鼠

ven T. Pleger, David M. Harris 等[31]通过利用 S100A1 敲除小鼠（SKO）与）小鼠来研究内源性 S100A1 在内皮细胞中的影响，发现内皮细胞中的A1 蛋白积极参与血管调节功能，其中 S100A1 敲除小鼠（SKO）的血压比）小鼠的血压高 24.1 %，同时与野生型相比，来自 S100A1 敲除小鼠（SK脉对于乙酰胆碱的响应显着降低，进一步说明 eNOS 的活化降低。S100ASKO）中受损的内皮性 NO 产生可以部分归因于内皮细胞（EC）中激动剂]i 减少。因此，内皮型 NO 合酶(nitric oxide synthase，NOS)可促进血管内皮稳定释放，而 S100A1 蛋白可通过调控 Ca2+和蛋白激酶 C 等途径调节内皮性，维持血管内皮细胞中 NO 的稳定。因此，S100A1 蛋白在改善血管疾中的内皮功能障碍过程中成为一种新型的治疗手段。体血管内皮细胞缺乏 S100A1 表现出对 VEGF 和缺氧导致的 NO 减少，并减少，迁移率降低和毛细血管形成受损。随后的生物化学分析中，VEGF乏 S100A1 的内皮细胞中抑制 eNOS Thr495 位点的过度磷酸化，进一步研eNOS Thr495 的磷酸化依赖于 PKC 活性的提高。S100A1 通过提高细胞内度，形成 Ca/CaM 复合物与 eNOS 结合，与 Ca2+靶向结合和对 PKC 依赖性 eNOS 相互作用已被证明是对局部缺血性血管生成反应不可或缺的先决条

【相似文献】