甲基苯丙胺对急性中毒期和停药期的大鼠心室肌钾、钠离子通道表达的影响

发布时间：2017-05-26 16:18

  本文关键词：甲基苯丙胺对急性中毒期和停药期的大鼠心室肌钾、钠离子通道表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 甲基苯丙胺(Methamphetamine, MA)是一种属于苯丙胺类的精神兴奋剂,俗称为冰毒,是联合国精神药品公约管制的精神活性毒品,具有价格相对低廉、见效快和药效维持时间长的特点,使之成为了广泛被滥用的毒品。甲基苯丙胺在中枢神经系统中是一种高度活跃的兴奋剂,从而导致成瘾行为。但其在作用于中枢神经系统的同时,也对心血管系统产生毒性影响,包括血管收缩、动脉缺血、心率增加、血压增加、心律失常和心律失常性猝死等已经被广泛的报道,成为了甲基苯丙胺心脏毒性的指标。 甲基苯丙胺除了对心率和血压有影响,也扰乱了心脏的电活动协调,造成心电图中QT间隔的延长,因此,甲基苯丙胺诱导的心脏性猝死可能与心脏的电活动异常有关。甲基苯丙胺滥用者的心电图中QT间隔的延长,提示了甲基苯丙胺滥用者易患有心室性心律失常,尤其是扭转型室性心动过速。这些电生理的变化可能归因于甲基苯丙胺对心脏离子通道的影响。 甲基苯丙胺可能直接作用于离子通道从而导致心律失常,也可能是甲基苯丙胺引起心肌细胞损伤后,细胞内离子及电生理活动发生了改变,导致了心电节律异常,从而间接导致了心脏的毒性损伤。但是,甲基苯丙胺对心脏离子通道的表达的影响并没有被证实。 本实验从体外及体内两个研究体系入手,主要研究甲基苯丙胺是否可以影响钾离子通道和钠离子通道相关亚基的表达,探讨甲基苯丙胺对心脏的毒性作用。分析甲基苯丙胺对大鼠心室肌离子通道的表达水平的影响。同时,对甲基苯丙胺停药后大鼠心室肌离子通道的表达的可逆效应作出评估,探讨甲基苯丙胺引起的电生理重构后果与离子通道表达重构之间的联系。 目的 通过在体外环境构建甲基苯丙胺染毒原代培养新生大鼠心室肌细胞毒性模型,调查甲基苯丙胺对大鼠心室肌细胞离子通道的影响；通过在体内环境构建甲基苯丙胺急性中毒大鼠模型,验证体外环境甲基苯丙胺对原代培养新生大鼠心室肌细胞的毒性作用,研究及分析甲基苯丙胺对大鼠心室肌离子通道的表达水平的影响；建立急性中毒后不同时间的停药模型,探讨甲基苯丙胺对大鼠心室肌离子通道影响的可恢复性和停止染毒后不同时间的恢复程度。 以上研究为甲基苯丙胺诱导心律失常发生,提供分子和电生理机制的基础。 方法 本实验分成两个部分,分别从体外与体内两个方向对甲基苯丙胺引起的心室肌毒性进行研究。 一、甲基苯丙胺对新生大鼠心室肌细胞的影响 1、甲基苯丙胺染毒原代培养新生大鼠心室肌细胞模型的建立 (1)出生1天内的SD乳鼠,雌雄不拘,心室肌细胞分离及原代培养,将培养72h已呈规律搏动的心室肌细胞随机分为四组,弃去培养基,Hank's液轻柔洗涤一次,按照0.5/1.0/1.5mM浓度分别给予含有相应浓度甲基苯丙胺的D-MEM液,并设立对照组,一并放入C02培养箱内继续培养。 (2)甲基苯丙胺染毒后对心室肌细胞进行形态学观察。 2、甲基苯丙胺对原代培养新生大鼠心室肌钾、钠离子通道蛋白影响 (1)实时荧光定量PCR技术：检测甲基苯丙胺作用原代培养新生大鼠心室肌细胞SCNNIA, SCNNIB, KCNA4, KCNA7, KCNC4, KCND2, KCNJ2, KCNJ12, KCNJ4, KCNJ14基因表达水平。 (2)Western Blot技术：检测甲基苯丙胺作用原代培养新生大鼠心室肌细胞SCNN1A,SCNN1B,KCNA4,KCNA7,KCNC4,KCND2,KCNJ2,KCNJ12,KCNJ4, KCNJ14蛋白表达水平。二、甲基苯丙胺对急性中毒期和停药期的大鼠心室肌的影响 1、急性组和停药组甲基苯丙胺中毒大鼠模型建立 (1)急性组(M1组)：200-220g雄性SD大鼠10只,单笼饲养,饲养于昼夜循环(光照14小时/天)空调恒温25℃的动物房,自由进食饮水,适应一周后,腹腔注射5mg/Kg甲基苯丙胺生理盐水溶液,2次/天(8AM及8PM各1次),连续给药一周(共14次)。建模成功后24小时心脏取材。 (2)停药组：200-220g雄性SD大鼠40只,随机分成W1、W2、W4和W8四组,每组10只,单笼饲养,饲养于昼夜循环(光照14小时/天)空调恒温25℃的动物房,自由进食饮水,适应一周后,腹腔注射5mg/Kg甲基苯丙胺生理盐水溶液,2次/天(8AM及8PM各1次),连续给药一周(共14次)。急性中毒建模成功后,停药喂养一周(Wl组)、两周(W2组)、四周(W4组)、八周(W8组),建模成功后24小时心脏取材。 (3)对照组(S1组)：200-220g雄性SD大鼠10只,将甲基苯丙胺生理盐水溶液换为等量生理盐水溶液,余处理同急性组,建模成功后24小时心脏取材。 2、甲基苯丙胺对急性中毒期和停药期的大鼠心室肌钾离子通道表达的影响 (1)实时荧光定量PCR技术：检测甲基苯丙胺作用急性组和停药组大鼠KCNA4, KCNA7,KCNC4,KCND2,KCNJ2,KCNJ12,KCNJ4,KCNJ14基因表达水平. (2)Western Blot技术：检测甲基苯丙胺作用急性组和停药组大鼠KCNA4,KCNA7,KCNC4,KCND2,KCNJ2,KCNJ12,KCNJ4,KCNJ14蛋白表达水平. 结果 一、甲基苯丙胺对新生大鼠心室肌细胞的影响 1、甲基苯丙胺染毒原代培养新生大鼠心室肌细胞模型的建立 甲基苯丙胺给药24小时后,0.5mM、1.0mM组及1.5mM组细胞搏动频率增快,细胞的形态未见明显变化。给药48小时后,0.5mM组细胞细胞搏动逐渐平复回落,少数的细胞变圆变扁梭；1.OmM组细胞搏动逐渐平复并明显变慢,并呈不规则搏动,细胞变圆变扁梭；1.5mM组细胞搏动频率不规则并明显变慢。随着染毒时间的递增,细胞损伤加重,最终细胞停止搏动,白皿上脱落、死亡。1.5mM组细胞损伤程度较1.0mM组为重并且快。在此期间,对照组心室肌细胞生长良好,细胞搏动规则有力。 2、甲基苯丙胺对新生大鼠心室肌细胞钾、钠离子通道表达的影响 0.5mM浓度的甲基苯丙胺染毒处理原代培养新生大鼠心室肌细胞钠离子通道各亚基的转录水平和翻译水平存在相应的变化。甲基苯丙胺对新生大鼠心室肌细胞钠离子通道SCNN1A, SCNN1B亚基的基因表达水平并无影响,与对照组相比差异无统计学意义(P0.05).SCNNlA:Con为1.004±0.015,MA为1.039±0.051；SCNN1B:Con为1.004±0.025,MA为0.985±0.060。甲基苯丙胺对新生大鼠心室肌细胞钠离子通道SCNN1A, SCNN1B亚基的蛋白表达水平并无影响,与对照组相比差异无统计学意义(P0.05).(SCNN1A:Con为1.004±0.015,MA为1.069±0.081；SCNN1B:Con为1.004±0.025,MA为0.981±0.090)。0.5mM浓度的甲基苯丙胺染毒处理后原代培养新生大鼠心室肌细胞内钾离子通道各亚基KCNA4,KCNA7,KCNC4,KCND2,KCNJ2,KCNJ12,KCNJ4,KCNJ14的转录水平和翻译水平存在相应的下调变化,与对照组相比差异有统计学意义。转录水平：KCNA4:Con为1.000±0.013,MA为0.515±0.052；KCNA7:Con为1.000±0.011,MA为0.539±0.041；KCNC4:Con为1.000±0.020,MA为0.303±0.080；KCND2:Con为1.000±0.015,MA为0.366±0.050；KCNJ2:Con为1.000±0.022,MA为0.411±0.061；KCNJ12:Con为1.003±0.015,MA为0.343±0.063；KCNJ4:Con为1.002±0.019,MA为0.418±0.052；KCNJ14:Con为1.001±0.015,MA为0.537±0.041).翻译水平：KCNA4:Con为1.004±0.019, MA为0.225±0.062；KCNA7:Con为1.001±0.015,MA为0.527±0.051；KCNC4:Con为1.001±0.036,MA为0.184±0.060；KCND2:Con为1.000±0.018,MA为0.555±0.050;KCNJ2:Con为1.003±0.016,MA为0.410±0.051;KCNJ12: Con为1.003±0.024,MA为0.298±0.050；KCNJ4:Con为1.006±0.015,MA为0.591±0.052；KCNJ14:Con为1.006±0.022,MA为0.398±0.041. 二、甲基苯丙胺对急性中毒期和停药期的大鼠心室肌的影响 1、急性组和停药组甲基苯丙胺中毒大鼠模型的建立 实验组动物腹腔注射甲基苯丙胺后约10分钟开始出现活动和行为异常,主要表现有立毛、翘尾,磨牙、运动增多、不自主的摇头和点头、自发转圈运动,遇响动或轻微刺激易激惹、个别动物啃咬前肢及足趾,实验组动物出现了刻板运动及自残行为。活动和行为异常持续至注射后4小时左右,药效消退后动物表现为活动减少、蜷缩、进食量减少。 2、甲基苯丙胺对急性中毒期和停药期的大鼠心室肌钾离子通道表达的影响 甲基苯丙胺急性中毒期的大鼠心室肌内钾通道蛋白的mRNA水平及蛋白水平表达的下降。KCNA4的mRNA表达下降55%,蛋白表达下降86%;KCNA7的mRNA表达下降69%,蛋白表达下降60%;KCNC4的mRNA表达下降77%,蛋白表达下降80%;KCND2的mRNA表达下降60%,蛋白表达下降53%；KCNJ2的mRNA表达下降79%,蛋白表达下降70%；KCNJ12的mRNA表达下降80%,蛋白表达下降81%；KCNJ4的mRNA表达下降67%,蛋白表达下降60%;KCNJ14的mRNA表达下降65%,蛋白表达下降86%。 甲基苯丙胺停药期中,KCNA4在停药后一周及两周,mRNA表达未发生明显变化,蛋白表达在停药后一周恢复33%,在停药后两周恢复37%,在停药后四周后,mRNA表达恢复30%,蛋白表达恢复57%,在停药后八周后,mRNA表达恢复89%,蛋白表达恢复94%;KCNA7在停药后一周,mRNA表达及蛋白表达均未发生明显变化,在停药后两周,mRNA表达未发生明显变化,蛋白表达恢复45%,在停药后四周后,mRNA表达恢复41%,蛋白表达恢复50%,在停药后八周后,mRNA表达恢复81%,蛋白表达恢复52%；KCNC4在停药后一周,mRNA表达及蛋白表达均未发生明显变化,在停药后两周后,mRNA表达恢复24%,蛋白表达恢复34%,在停药后四周后,mRNA表达恢复66%,蛋白表达恢复62%,在停药后八周后,mRNA表达恢复75%,蛋白表达恢复89％；KCND2在停药后一周,mRNA表达下降43%,蛋白表达下降47%,在停药后两周,mRNA表达下降12%,蛋白表达与给药组没有差异,在停药后四周后,mRNA表达恢复65%,蛋白表达恢复67%,在停药后八周后,mRNA表达恢复85%,蛋白表达恢复74%。 KCNJ2在停药后一周,mRNA表达恢复20%,蛋白表达恢复25%,在停药后两周后,mRNA表达恢复34%,蛋白表达恢复22%,在停药后四周后,mRNA表达恢复38%,蛋白表达恢复23%,在停药后八周后,mRNA表达恢复49%,蛋白表达恢复50％；KCNJ12在停药后一周及两周,mRNA表达及蛋白表达均未发生明显变化,在停药后四周后,mRNA表达恢复35%,蛋白表达恢复39%,在停药后八周后,mRNA表达恢复66%,蛋白表达恢复68%；KCNJ4在停药后一周,mRNA表达及蛋白表达均未发生明显变化,在停药后两周后,mRNA表达恢复26%,蛋白表达恢复21%,在停药后四周后,mRNA表达恢复36%,蛋白表达恢复12%,在停药后八周后,mRNA表达恢复42%,蛋白表达恢复16%;KCNJ14在停药后一周,mRNA表达及蛋白表达均未发生明显变化,在停药后两周后,mRNA表达恢复38%,蛋白表达未发生明显变化,在停药后四周后,mRNA表达恢复60%,蛋白表达未发生明显变化,在停药后八周后,mRNA表达恢复70%,蛋白表达恢复37%。 结论 本实验选择了使用分化完成之前分离的原代培养新生大鼠心室肌细胞,不同浓度的甲基苯丙胺给药后,细胞搏动频率均为开始时增快随后减慢,随着染毒时间的递增,细胞损伤加重,最终细胞停止搏动、死亡。 在体外研究体系中,甲基苯丙胺引起了钾离子通道各亚基mRNA水平和蛋白水平的下降。甲基苯丙胺对心室肌细胞的瞬时外向钾电流(Ito)和内向整流钾电流(IKl)通道有抑制性影响,对相应的离子通道表达也有抑制性影响。由于运作的离子通道的数量的减少可以导致Itp,IKl的减低,所以离子通道表达水平是一个合理的指标去评估甲基苯丙胺对致心律失常性重构涉及到的离子通道的影响。另外,转录或翻译的Ito, Ik1基因减少也可以导致离子通道数量的减少。 急性组和停药组甲基苯丙胺中毒大鼠模型的建立过程中能观察到注射给药后10分钟左右,大鼠出现了明显的毒性反应,活动和行为异常、刻板运动及自残行为。兴奋、易激惹、不自主的转圈、摇头和点头,并伴有呼吸深快、立毛、翘尾、磨牙、等改变。数小时后药效消退,大鼠出现了精神萎靡、明显的活动减少、进食量减少。这些表现均符合甲基苯丙胺中毒的药理作用特点。 在体内研究体系中,甲基苯丙胺引起了钾离子通道各亚基mRNA水平和蛋白水平的下降。甲基苯丙胺对Ito, Ik1有抑制性影响,对相应的钾离子通道各亚基的表达也有抑制性影响。 甲基苯丙胺停药后,钾离子通道各亚基表达存在可逆变化。当甲基苯丙胺停药2周后,可以观察到某些离子通道亚基的表达有略微可逆的调节。大多数离子通道亚基的表达则没有改变。大多数离子通道亚基的表达在甲基苯丙胺停药后两周内仍然保持相对不可逆转的状态。在一定的程度上,离子通道的功能会受到影响并可能诱导电流重构。因此,这个时期正正可能是甲基苯丙胺诱导心律失常出现的风险时期。 大多数离子通道亚基的表达在甲基苯丙胺停药后四周开始恢复。甲基苯丙胺停药后八周,所有的离子通道亚基均可观察到表达的恢复。离子通道亚基表达的恢复可能有助于改善离子通道的功能,从而缓解对电流重构的影响。 尽管如此,甲基苯丙胺停药后八周各离子通道亚基恢复的表达与对照组的表达相比还是有一些差距。本实验的数据表明,钾离子通道各亚基的表达仍然无法恢复到对照组的表达水平,进一步表明了即使甲基苯丙胺停药后两个月,钾离子通道各亚基的表达重构仍然继续存在,因此,甲基苯丙胺诱导心律失常的风险可能会存在一段时间。 我们发现甲基苯丙胺停药后八周,Kir2.0家族的可恢复性比其他亚基的恢复性较差。Kir2.0家族较差的可恢复性提示IkI电流和离子信号的改变增加了心律失常发生的风险。Ikl的生理功能是调整静态电位和动作电位的复极化。IKl的抑制可以提高膜电位和延长动作电位持续时间。研究结果表明,Kir2.0家族表达的重构可能是甲基苯丙胺诱导心脏损伤在康复期晚期心律失常发生的一个可能的诱导因素。
【关键词】：甲基苯丙胺 钾离子通道 钠离子通道 心脏毒性 心律失常
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：D919.1
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-30
• 参考文献25-30
• 第一章 甲基苯丙胺对新生大鼠心室肌细胞的影响30-52
• 第一节 甲基苯丙胺染毒原代培养新生大鼠心室肌细胞模型的建立30-35
• 1.1 材料与方法30-33
• 1.2 结果33-34
• 1.3 讨论34-35
• 第二节 甲基苯丙胺对新生大鼠心室肌细胞钾、钠离子通道表达的影响35-50
• 2.1 材料与方法35-46
• 2.2 结果46-49
• 2.3 讨论49-50
• 参考文献50-52
• 第二章 甲基苯丙胺对急性中毒期和停药期的大鼠心室肌的影响52-88
• 第一节 急性组和停药组甲基苯丙胺中毒大鼠模型的建立52-56
• 1.1 材料与方法52-54
• 1.2 结果54
• 1.3 讨论54-56
• 第二节 甲基苯丙胺对急性中毒期和停药期的大鼠心室肌钾离子通道表达的影响56-86
• 2.1 方法与材料56-66
• 2.2 结果66-84
• 2.3 讨论84-86
• 参考文献86-88
• 全文小结88-89
• 中英文缩略对照表89-90
• 攻读硕士学位期间发表及撰写论文情况90-91
• 致谢91-92

【参考文献】

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1 张西;;苯丙胺类兴奋剂三次滥用高峰的历史嬗变[J];中国人民公安大学学报(自然科学版);2011年01期

2 ;MYOCARDIAL LESIONS AFTER LONG-TERM ADMINISTRATION OF METHAMPHETAMINE IN RATS[J];Chinese Medical Sciences Journal;2008年04期

  本文关键词：甲基苯丙胺对急性中毒期和停药期的大鼠心室肌钾、钠离子通道表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：397432