rAAV2介导IGF-I基因联合间充质干细胞对骨骼肌钝挫伤小鼠修复作用的研究

发布时间：2017-06-10 08:09

  本文关键词：rAAV2介导IGF-I基因联合间充质干细胞对骨骼肌钝挫伤小鼠修复作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨骼肌损伤的防治一直是运动医学领域中的热点和难点,其伤后炎症反应期长,愈合质量较差,容易形成瘢痕愈合。尽管国内在分子生物学领域已经取得一定进展,但是目前在临床仍未能找到预防和治疗骨骼肌损伤公认的最佳方案。研究目的:本实验对ICR小鼠进行骨骼肌钝挫伤造模后,采用rAAV2介导的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、人脐带血间充质干细胞(MSC),对急性骨骼肌钝挫伤小鼠进行干预治疗,从组织学、生物化学等不同的研究层次和角度,探讨基因及间充质干细胞对骨骼肌损伤的治疗作用及可能机制,比较单纯基因治疗、单纯间充质干细胞、以及两者联合干预对骨骼肌钝挫伤小鼠的修复效果,丰富相应研究资料。研究方法:动物分组与处理:将68只雄性ICR小鼠随机分为空白对照组(4只)和实验组(64只),实验组小鼠骨骼肌钝挫伤造模后平均分为四组,每组16只,各实验组又根据取材时间不同,分为伤后3天组,伤后7天组,伤后14天组,伤后21天组。基因治疗组(rAAV-IGF-Ⅰ)在造模后即刻用微量注射器注射40μL重组腺相关病毒,间充质干细胞组(MSC)注射106个细胞,联合治疗组(rAAV-IGF-Ⅰ-MSC)注射经腺相关病毒感染后的间充质干细胞106个,自然愈合组注射40μL PBS。分别在损伤后3d、7d、14d、21d处死动物,眼球取血,留取血清,Eppendoff管密封保存于-80℃冰箱待测;速取损伤区域腓肠肌,用生理盐水将残留血液清洗干净,其中二分之一置于冻存管中在液氮中速冻3-4小时,然后转移至-80℃冰箱保存待测,另外二分之一肌肉用10%福尔马林固定,用于HE染色观察及免疫组织化学实验。研究结果:(1)重组腺相关病毒介导的近红外荧光蛋白iRFP713能够在受伤肌肉组织中广泛表达,对照组无表达。(2)HE染色光镜观察、血浆CK活性变化表明MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能促进小鼠急性腓肠肌钝挫伤后的肌肉再生,减少疤痕形成,提高愈合质量。(3)外源IGF-Ⅰ能在小鼠腓肠肌中稳定表达,在第14d时,IGF-Ⅰ含量从高到低分别为rAAV-IGF-Ⅰ-MSC组、rAAV-IGF-Ⅰ组、MSC组、自然愈合组、安静对照组。(4)MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能抑制骨骼肌钝挫伤小鼠局部组织Collagen-Ⅰ、ⅢmRNA的表达,第7d、14d、21d,Collagen-ⅠmRNA的表达量均低于自然愈合组(P0.01),第3d,rAAV-IGF-Ⅰ组与自然愈合组相比无统计学差异(P0.05),其余两组差异显著(P0.05)。第14d,rAAV-IGF-Ⅰ-MSC与MSC组也表现出非常显著性差异(P0.01)。21天,rAAV-IGF-Ⅰ组是MSC组的76%(P0.01),rAAV-IGF-Ⅰ-MSC组是MSC组的58%(P0.01)。小鼠发生急性骨骼肌损伤3天和第7天时,各治疗组Collagen-ⅢmRNA的表达量与自然愈合组相比均有显著性差异(P0.01),组间无统计学差异(P0.05)。第14d,MSC组是自然愈合组的74%(P0.05),rAAV-IGF-Ⅰ组是自然愈合组的63%(P0.01),rAAV-IGF-Ⅰ-MSC组自然愈合组的42%(P0.01)。rAAV-IGF-Ⅰ-MSC组的Collagen-ⅢmRNA的表达量与MSC组相比也具有统计学差异(P0.05)。第21天,rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC两组的Collagen-ⅢmRNA的表达量均低于自然愈合组(P0.01)。研究结论:(1)MSC及IGF-Ⅰ对小鼠急性骨骼肌损伤有治疗作用(2)MSC对急性骨骼肌损伤小鼠腓肠肌作用时间较快,但作用持续时间较短(3)rAAV2介导的IGF-Ⅰ对急性骨骼肌损伤小鼠腓肠肌作用时间较慢,但作用持续时间长久(4)rAAV-IGF-Ⅰ-MSC治疗组要优于单纯MSC和rAAV-IGF-Ⅰ治疗组。
【关键词】：骨骼肌钝挫伤 重组2型腺相关病毒 胰岛素样生长因子-Ⅰ 间充质干细胞
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R873
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 序言10-12
• 文献综述12-25
• 1.胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）概述12-14
• 1.1 IGF-Ⅰ的生物学功能13
• 1.2 IGF-Ⅰ对骨骼肌的作用13-14
• 2.腺相关病毒概述14-16
• 3.间充质干细胞概述16-20
• 3.1 间充质干细胞的发现16-17
• 3.2 MSC的临床应用前景17-19
• 3.3 间充质干细胞治疗骨骼肌损伤19-20
• 4 骨骼肌损伤概述20-25
• 4.1 骨骼肌损伤的分类20-21
• 4.2 急性骨骼肌损伤的造模方法21-22
• 4.3 骨骼肌损伤的治疗方法22-25
• 1 材料与方法25-42
• 1.1 实验动物与分组25
• 1.2 小鼠腓肠肌急性钝挫伤模型的建立25
• 1.3 携带人IGF-Ⅰ基因的重组腺相关病毒载体（rAAV2-IGF-Ⅰ）包装及鉴定25-35
• 1.3.1 pTR-iRFP713-IRES-IGF-Ⅰ质粒构建25-31
• 1.3.2 pAAV-iRFP713-IRES-IGF-Ⅰ、PDG质粒的大量制备31
• 1.3.3 rAAV2-IGF-Ⅰ病毒包装31-32
• 1.3.4 rAAV2-IGF-Ⅰ的分离和纯化32-33
• 1.3.5 rAAV2-IGF-Ⅰ滴度测定33-34
• 1.3.6 重组病毒鉴定34-35
• 1.4 小鼠肌肉注射细胞、病毒35-36
• 1.5 取材与指标检测36-40
• 1.5.1 血液、肌肉取材36
• 1.5.2 HE染色36
• 1.5.3 IGF-Ⅰ 免疫组化及图像分析36-37
• 1.5.4 小鼠腓肠肌Collagen-ⅠmRNA、Collagen-Ⅲ mRNA含量测定37-39
• 1.5.5 小鼠血清肌酸激酶（CK）酶联免疫分析39-40
• 1.6 主要实验仪器和试剂40-41
• 1.6.1 实验主要仪器40-41
• 1.7 数据统计处理41-42
• 2 实验结果42-56
• 2.1 RAAV2 IGF-Ⅰ病毒包装结果及其在细胞内IRFP713报告基因的表达42-47
• 2.1.1 pTR-EGFP-IRES-IGF-Ⅰ质粒鉴定结果42
• 2.1.2 pTR-iRFP713-IRES-IGF-Ⅰ质粒鉴定结果42-43
• 2.1.3 pAAV-IRFP713-IRES-IGF-Ⅰ质粒鉴定结果43-44
• 2.1.4 rAAV2-IGF-Ⅰ腺相关病毒包装、鉴定及病毒滴度测定44-46
• 2.1.5 rAAV2 IGF-Ⅰ腺相关病毒感染细胞及功能基因IGF-Ⅰwestern-blot鉴定46-47
• 2.2 肌肉注射rAAV2-IGF-Ⅰ、rAAV2-IGF-Ⅰ-MSC后iRFP报告基因表达比较47
• 2.3 各组小鼠肌肉组织HE染色光镜结果观察比较47-50
• 2.4 各组小鼠肌肉组织IGF-Ⅰ免疫组化结果比较50-52
• 2.5 不同治疗方法对急性骨骼肌钝挫伤小鼠腓肠肌Collagen-Ⅰ、Ⅲ mRNA表达的影响52-54
• 2.6 不同治疗方法对急性骨骼肌钝挫伤小鼠血清CK含量的影响54-56
• 3 分析与讨论56-61
• 3.1 腺相关病毒作为骨骼肌损伤基因治疗表达载体的可行性56
• 3.2 骨骼肌急性损伤后各组别的自然愈合过程56-57
• 3.3 骨骼肌损伤后各组别Collagen-Ⅰ、Ⅲ mRNA的表达57-59
• 3.4 骨骼肌损伤后各组别血清CK浓度变化59-61
• 4 结论61-62
• 参考文献62-69
• 攻读硕士期间公开发表的论文69-70
• 致谢70-71

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