模拟微重力下的血清miRNAs研究

发布时间：2017-10-18 23:04

  本文关键词：模拟微重力下的血清miRNAs研究

  更多相关文章： 微重力 血清miRNAs 生物标志物 骨质疏松 代谢组学 海马 认知功能 AQP4

【摘要】：长期空间飞行过程中,由于重力的消失迫使机体的多种组织和器官去适应新的微重力环境,从而产生一系列的适应性变化,称之为“空间适应综合症”。这些航天医学问题已成为人类长期太空探索的重要障碍之一,主要包括骨丢失、认知功能损伤、肌肉萎缩、心血管功能紊乱等。航天微重力环境对航天员的生理健康和任务执行造成了严重影响,如何对这些影响进行监测和防护并揭示其机制,是航天医学研究的首要任务。开发简单有效的检测指标对于航天员的生理健康监测具有重要意义。同时,以系统生物学的思维来探索微重力对机体动态的、全身性的影响,将是航天医学问题研究的有效手段。本论文以尾吊大鼠作为主要的动物模型,通过对血清miRNAs表达谱的研究来探索模拟微重力对机体的影响,获得以下主要结果：首先对血清miRNAs的内参基因进行了筛选和验证。通过miRNAs芯片筛选,并结合多批次、大样本的qPCR及2个专业内参筛选软件(geNorm和Normfinder)的运算分析,确定了miR-25-3p是最稳定的内参基因。进一步分析表明,miR-25-3p是一个在不同物种间高度保守的基因。它在大鼠尾吊、猕猴卧床等模拟微重力模型,以及大鼠OVX、绝经后骨质疏松等模型中的表达均有很好的稳定性,从而最终确定miR-25-3p可作为这些模型中稳定的血清miRNAs内参基因。这些结果为后续开展的的血清miRNAs研究奠定了基础。随后我们对失重性骨丢失和绝经后骨质疏松的血清miRNAs标志物进行了筛选。利用大鼠OVX血清miRNAs芯片技术高通量筛选差异表达的miRNAs,并经qPCR验证得到15个下调的miRNA。进一步结合临床样本检测后发现,其中miR-30b-5p在骨质减少和骨质疏松病人血清中都显著下调,miR-103-3p、 miR-142-3p和miR-328-3p在骨质疏松病人血清中显著下调。偏相关分析发现它们与H-BMD之间均存在显著的正相关,而且miR-30b-5p和miR-142-3p还同时与]N-BMD显著相关。这4个niRNAs可作为绝经后骨质疏松的生物标志物。利用猕猴卧床实验对模拟失重性骨丢失的标志物进行了鉴定,结果发现miR-30b-5p、miR-103-3p和miR-142-3p在卧床后猕猴血清中的表达显著下降,ROC曲线分析表明它们有很好的诊断价值,但miR-328-3p未发生显著变化。从而确定miR-30b-5p、miR-103-3p和miR-142-3p可作为模拟失重性骨丢失的标志物。miRNA表达谱和代谢组学数据都包含了生理变化的重要信息,为了对数据进行深度挖掘,我们进行了二者的联合分析。血清miRNAs芯片和qPCR检测确定了13个在尾吊4周和5周后大鼠血清中均上调的miRNAs,pather和DAVID软件的分析表明它们与神经系统,尤其是海马高度相关。连续尾吊5周后,血清代谢组发生显著性变化,与变化miRNAs的预测靶基因进行联合分析发现,模拟失重对机体的神经系统尤其是海马区有显著影响。根据生物信息学分析结果,我们检测了尾吊大鼠海马组织miRNA、mRNA和蛋白的表达,发现miR-383-5p的表达显著上调,同时其预测靶基因AQP4的mRNA和蛋白水平均显著下调,推测它可能直接受miR-383-5p的靶向调控。通过体外双荧光素酶报告基因实验,确认了AQP4是miR-383-5p的靶基因。AQP4是调节脑组织水平衡的重要蛋白,也与海马的学习记忆和认知功能密切相关。因此,推测它的变化是微重力影响海马功能的潜在机制之一,并可能与微重力下的血液头向分布相关。综上所述,我们通过对血清miRNAs的研究发现：miR-25-3p是模拟微重力模型和骨质疏松模型稳定的内参基因；并筛选得到一组血清miRNAs可作为模拟失重性骨丢失和绝经后骨质疏松的潜在标志物；最后对模拟微重力导致的认知功能损伤进行了初步的机制探索。
【关键词】：微重力 血清miRNAs 生物标志物 骨质疏松 代谢组学 海马 认知功能 AQP4
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R85
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略表12-20
• 第一章 绪论20-50
• 1.1 长期空间飞行面临的航天医学问题20-26
• 1.1.1 失重对骨的影响20-22
• 1.1.2 失重对认知功能的影响22-24
• 1.1.3 失重对体液循环的影响24-25
• 1.1.4 失重对其他生理系统的影响25
• 1.1.5 组学在航天医学研究中的应用25-26
• 1.2 miRNAs概述26-29
• 1.2.1 miRNAs的发现26-27
• 1.2.2 miRNAs对骨的调控作用27-28
• 1.2.3 miRNA与海马认知功能28-29
• 1.3 循环miRNAs概述29-37
• 1.3.1 循环miRNAs的发现29-30
• 1.3.2 循环miRNAs的特点30
• 1.3.3 循环miRNAs的存在形式与分泌机制30-32
• 1.3.4 循环miRNAs的内参研究32-33
• 1.3.5 循环miRNAs与疾病诊断33-35
• 1.3.5.1 循环miRNAs作为疾病的生物标志物33-34
• 1.3.5.2 循环miRNAs作为骨质疏松的生物标志物34-35
• 1.3.6 循环miRNAs作为信号分子参与组织或细胞间相互调控35-37
• 1.3.7 循环miRNAs的组学研究37
• 1.4 总结37-38
• 参考文献38-50
• 第二章 血清miRNAs内参基因的筛选与鉴定50-79
• 2.1 引言50-51
• 2.2 实验材料51-54
• 2.2.1 实验动物与样品51
• 2.2.2 实验仪器与耗材51-52
• 2.2.3 实验试剂52-53
• 2.2.4 溶液配制53-54
• 2.3 实验方法54-65
• 2.3.1 动物模型的建立54-56
• 2.3.1.1 大鼠尾吊模型的建立54
• 2.3.1.2 大鼠卵巢摘除模型的建立54-55
• 2.3.1.3 猕猴头低位卧床模型的建立55-56
• 2.3.2 实验动物取材56-57
• 2.3.2.1 血液采集和血清分离56
• 2.3.2.2 大鼠后肢骨分离56-57
• 2.3.3 原代颅骨成骨细胞分离培养与骨向诱导57
• 2.3.4 原代骨髓单核细胞破骨细胞向诱导分化57-58
• 2.3.5 μCT检测分析58
• 2.3.6 miRNAs的提取58-62
• 2.3.6.1 血清miRNAs的提取58-59
• 2.3.6.2 细胞总RNAs的提取59-60
• 2.3.6.3 大鼠股骨总RNAs的提取60-61
• 2.3.6.4 总RNAs的质量检测61-62
• 2.3.7 尾吊大鼠血清miRNAs芯片检测62-63
• 2.3.8 miRNA的表达检测63-65
• 2.3.9 数据统计分析65
• 2.4 实验结果65-73
• 2.4.1 大鼠尾吊模型的建立65-66
• 2.4.2 血清miRNAs候选内参基因的选择66-67
• 2.4.3 血清miRNAs内参基因的选择与验证67-70
• 2.4.4 miR-25-3p是模拟微重力模型稳定的血清miRNAs内参基因70-71
• 2.4.5 miR-25-3p作为内参基因在骨质疏松模型中的稳定性71-73
• 2.5 讨论73-75
• 2.6 本章小结75
• 参考文献75-79
• 第三章 骨质疏松血清miRNAs标志物的筛选79-95
• 3.1 引言79-80
• 3.2 实验材料80-81
• 3.2.1 实验动物与样品80
• 3.2.2 实验仪器与耗材80
• 3.2.3 实验试剂80-81
• 3.3 实验方法81-83
• 3.3.1 血清样品的获取81
• 3.3.2 OVX大鼠血清miRNAs芯片检测81
• 3.3.3 血清miRNA的提取与检测81-82
• 3.3.4 数据统计分析82-83
• 3.4 实验结果83-89
• 3.4.1 大鼠OVX模型中差异表达的血清miRNAs83-84
• 3.4.2 血清miRNAs作为绝经后骨质疏松的潜在标志物84-87
• 3.4.3 血清miRNAs作为模拟失重性骨丢失的潜在标志物87-89
• 3.5 讨论89-91
• 3.6 本章小结91
• 参考文献91-95
• 第四章 血清miRNAs表达谱与代谢组学的联合分析95-106
• 4.1 引言95
• 4.2 实验材料95-96
• 4.2.1 实验动物与样品95
• 4.2.2 实验仪器与耗材95-96
• 4.2.3 实验试剂96
• 4.3 实验方法96-98
• 4.3.1 血清样品的获取与检测96
• 4.3.2 血清代谢组学检测96-98
• 4.3.2.1 血清样本预处理96-97
• 4.3.2.2 血清样本LC-MS分析97
• 4.3.2.3 血清样本数据预处理97
• 4.3.2.4 数据多变量分析和代谢标志物鉴定97-98
• 4.3.3 生物信息学分析98
• 4.3.4 数据统计分析98
• 4.4 实验结果98-104
• 4.4.1 大鼠尾吊模型中差异表达的血清miRNAs98-102
• 4.4.2 尾吊大鼠血清代谢组的检测与分析102-103
• 4.4.3 尾吊大鼠血清miRNAs芯片和代谢组的联合分析103-104
• 4.5 讨论104
• 4.6 本章小结104-105
• 参考文献105-106
• 第五章 大鼠尾吊模拟微重力对海马的影响106-126
• 5.1 引言106
• 5.2 实验材料106-109
• 5.2.1 实验动物与细胞106-107
• 5.2.2 实验仪器与耗材107
• 5.2.3 实验试剂107-109
• 5.2.4 溶液配制109
• 5.3 实验方法109-116
• 5.3.1 mRNAs的表达检测109-111
• 5.3.2 组织/细胞蛋白提取111-112
• 5.3.2.1 海马组织蛋白提取111-112
• 5.3.2.2 细胞蛋白提取112
• 5.3.2.3 蛋白浓度测定112
• 5.3.3 AQP4基因3'-UTR荧光素酶报告基因质粒构建112-115
• 5.3.3.1 AQP4的3'-UTR扩增112-113
• 5.3.3.2 荧光素酶报告基因载体准备113-114
• 5.3.3.3 重组质粒构建114-115
• 5.3.4 Western blot检测蛋白表达115
• 5.3.5 细胞转染115-116
• 5.3.6 双荧光素酶报告基因检测116
• 5.3.7 数据统计分析116
• 5.4 实验结果116-121
• 5.4.1 尾吊模拟微重力对大鼠海马组织miRNAs/mRNAs表达的影响116-119
• 5.4.2 尾吊模拟微重力对大鼠海马组织蛋白表达的影响119-120
• 5.4.3 AQP4是miR-383-5p的靶基因120-121
• 5.5 讨论121-123
• 5.6 本章小结123
• 参考文献123-126
• 第六章 结论与展望126-128
• 附录Ⅰ128-129
• 附录Ⅱ129

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