RGD介导多西他赛pH敏感脂质体的合成、制备、表征及体内外抗肿瘤活性评价

发布时间：2017-03-26 12:01

  本文关键词：RGD介导多西他赛pH敏感脂质体的合成、制备、表征及体内外抗肿瘤活性评价，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：多西他赛(Docetaxel, DTX),半合成紫杉醇类似物,是临床上广泛应用于乳腺癌、胰腺癌、晚期卵巢癌、、非小细胞肺癌等恶性肿瘤治疗的一线药物；通过加强微管蛋白聚集,使得细胞有丝分裂停留于G2/M期而凋亡；多西他赛,脂溶性大于水溶性,水中溶解量较低、体内非特异性分布等特点,临床应用中出现生物利用度比较低现象,明显削弱药物的临床抗肿瘤作用。临床中采用制剂为“多帕菲(?)”和“泰索帝(?)”注射液,处方中均含有大量Tween-80和乙醇用以增溶,其中辅料Tween-80易引起超敏反应、神经毒性、肾毒性等严重副反应。因此,设计和制备高靶向性新型药物传输体系,是目前亟待攻克的难题。脂质体具有良好相容性、缓控释及靶向性、长循环等优点,是最具潜力的新型药物、蛋白、基因等的递送系统之一；脂质体制备过程中加入pH敏感材料亚油酸(LA),进入肿瘤酸性微环境后,脂质双层膜不稳定破裂,迅速释放内容物；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列简写RGD,与整合素有较强特异性亲和力,尤其是αvβ3,近几年作为一种靶向因子得到广泛关注。本文首次合成RGD-PEG-LA,通过PEG链段的“架桥作用”将靶向因子RGD修饰在制剂表面；成功制备RGD介导的载多西他赛pH敏感脂质体(RGD/DTX-PSL),并考察其药剂学和生物学特性,研讨其抗肿瘤治疗的应用前景。本文主要研究内容如下：1 DTX-PSL的制备及理化性质考察本部分建立了HPLC法精确测定DTX体外含量。采用经典薄膜分散法制备,磷脂酰乙醇胺(PE)、胆固醇(CHOL)为主体组成物质,LA为pH敏感物质,包载模型药物DTX；主要考察制剂包封率高低,通过单因素实验和正交优化实验,获得DTX-PSL的最适宜处方组成和成熟制备工艺。同时对DTX-PSL制剂理化性质进行考察,包括平均粒径和粒径分布、Zeta电势、透射电镜(TEM)、载药量(DL%)和包封率(EE%)等指标的测定。测得DTX-PSL制剂的DL%为4.8±0.1%,EE%为81.9±2.2%；动态光散射法测得平均粒径及粒径分布为127.2±3.58 nm, PDI为0.218±0.15, Zeta电势为-35.19±1.27mV；TEM照片可观察制剂外观：圆形或类圆形,均一,表面完整光滑。2 RGD-PEG-LA分子的合成及RGD/DTX-PSL的制备采用固相合成法(FMOC-SPSS),按次序加入芴甲氧羰基N端占位修饰的分子,最终制备得到RGD-PEG-LA分子,并通过电喷雾质谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对结构进行鉴定；DTX-PSL最优处方中加入适量RGD-PEG-LA分子,薄膜分散法制得RGD/DTX-PSL,同样方法考察制剂平均粒径、Zeta电势、透射电镜照片,并表征DL%和EE%等；采用透析袋法,以多帕菲⑧为对照组,分别考察DTX-PSL和RGD/DTX-PSL在pH5.0、pH7.4含0.5% Tween-80磷酸盐释放介质中的释放行为。ESI-MS中最高峰M=347.1是RGD分子离子峰,说明RGD合成正确无误；分析RGD-PEG-NH2和RGD-PEG-LA分子MALDI-TOF-MS图谱,显示在理论分子量2383Da和2645Da处峰位较高,说明已获得目标分子RGD-PEG-LA。测得RGD/DTX-PSL制剂的DL%为4.3±0.2%,EE%为78.4+1.7%；动态光散射法测得平均粒径及粒径分布为146.4±4.38 nm, PDI为0.169±0.13, Zeta电势为-31.82±0.92mV；透射电镜照片中制剂成型完整,均匀如一。体外释放结果可知,与多帕菲(?)对照组相比,DTX-PSL和RGD/DTX-PSL制剂释放时间明显延长,具有较好缓释性；另外,DTX-PSL和RGD/DTX-PSL在pH5.0释放介质中较pH7.4介质释放速度快,且有明显突释现象,显示制剂具有一定pH敏感性；DTX-PSL和RGD/DTX-PSL制剂在不同pH环境中释放趋势相同,可知RGD靶向因子的存在并没改变脂质体的体外释放特性。3 DTX-PSL和RGD/DTX-PSL的体内、外抗肿瘤实验采用MTT法研究Duopafei(?), DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制剂对人乳腺癌MCF-7细胞的毒性作用；载香豆素-6脂质体(C6-PSL和RGD/C6-PSL)与MCF-7孵育后,倒置荧光显微镜定性查看荧光强度并拍照,流式细胞仪定量测定荧光摄取情况。荷瘤Balb/c-Nu尾静脉注射NBD-PSL、RGD/NBD-PSL制剂,共聚焦显微镜观察肿瘤切片中荧光强度；抑瘤率实验中测定鼠体重、肿瘤体积、剥离瘤块重量,考察制剂体内抗肿瘤活性。MTT实验中Duopafei(?)、DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制剂与MCF-7作用不同时间,能杀死一半细胞的药物浓度(IC50)分别为24 h：6.81+0.53、4.43+0.15、2.44+0.49,48 h：5.06+0.33、2.47q0.20、1.28±0.23,72 h：1.84±0.10、1.50±0.13、1.05+0.04。细胞摄取和肿瘤切片实验显示：两制剂组荧光强度远高于游离荧光材料组,且RGD/DTX-PSL组荧光强度高于未修饰脂质体组。抑瘤率实验中瘤体积大小为：生理盐水组Duopafei(?)DTX-PSLRGD/DTX-PSL。以上结果,说明本实验制备的靶向脂质体体内、外抗肿瘤效果良好。4 DTX-PSL和RGD/DTX-PSL大鼠体内药动学研究本实验以SD大鼠为实验动物,分别尾静脉注射Duopafei(?)、 DTX-PSL RGD/DTX-PSL制剂,按预设时间点颈静脉窦取血,液液萃取法处理血样,加入紫杉醇作为内标物,HPLC法测定血液中药物浓度,并利用DAS2.0处理得统计矩参数。DTX-PSL、 RGD/DTX-PSL制剂AUCo-∞(25.363,38.081)值均大于Duopafei(?)组AUC0-∝值(10.703),而CLz值(0.513,0.341)远小于Duopafei(?)组CLz(1.215),说明在相同时间点DTX-PSL、RGD/DTX-PSL组大鼠体内药浓度均高于Duopafei(?)组。另外,DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制剂t1/2z(2.455,3.478)分别为Duopafei(?)组t1/2z(1.187)的2倍、3倍,可知DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制剂能够明显延长药物在血液中的存留时间。综上所述,本文通过合成RGD-PEG-LA分子,将RGD分子修饰于pH敏感脂质体表面,制备工艺简单,粒径均匀,外观良好,极大提高多西他赛溶解度；通过pH敏感物理化学靶向及RGD主动靶向的联合作用,促使载药制剂准确的输送至肿瘤部位,减少正常组织中药物分布,大大减少多西他赛毒性,增强抗肿瘤疗效,为进一步发展安全、稳定、高效的药物运输体系提出了新思路。本论文由国家自然科学基金(No.21203112)支持完成。
【关键词】：多西他赛 脂质体 pH敏感 RGD 肿瘤治疗
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要20-24
• ABSTRACT24-27
• 符号说明27-30
• 前言30-37
• 第一章 载多西他赛pH敏感脂质体的药物含量测定37-50
• 一、仪器与试剂37-38
• 1. 仪器37
• 2. 药品与试剂37-38
• 二、实验方法38-41
• 1. 多西他赛抗肿瘤药物体外含量的测定38-39
• 1.1 检测波长的确定38
• 1.2 色谱条件38
• 1.3 标准曲线的绘制38
• 1.3.1 贮备液的配制38
• 1.3.2 标准曲线的建立38
• 1.4 专属性实验38-39
• 1.5 定量限及检测限的考察39
• 1.6 精密度实验39
• 1.7 回收率实验39
• 1.8 重现性实验39
• 2. 包封率检测方法的建立39-41
• 2.1 方法回收率40
• 2.2 加样回收率40-41
• 三、实验结果41-49
• 1. 多西他赛抗肿瘤药物体外含量的测定结果41-47
• 1.1 检测波长的确定41
• 1.2 色谱条件41-42
• 1.3 标准曲线的绘制42-43
• 1.4 专属性实验结果43
• 1.5 定量限及检测限的测定结果43-44
• 1.6 精密度实验结果44-45
• 1.7 回收率实验结果45-46
• 1.8 重现性实验结果46-47
• 2. 包封率检测方法考察结果47-49
• 2.1 方法回收率结果47-48
• 2.2 加样回收率结果48-49
• 四、本章小结49-50
• 第二章 多西他赛pH敏感脂质体的研究50-65
• 一、仪器与试剂50-51
• 1. 仪器50
• 2. 药品与试剂50-51
• 二、实验方法51-54
• 1. 制备多西他赛pH敏感型脂质体的方法考察51-52
• 1.1 乙醚注入法51
• 1.2 薄膜水化法51
• 1.3 冻融法51-52
• 2. 单因素考察52-53
• 2.1 药脂比52
• 2.2 胆固醇的量52
• 2.3 亚油酸的量52
• 2.4 水化温度52
• 2.5 水化时间52
• 2.6 水化体积52-53
• 3. 正交实验法优化制剂处方组成和制备工艺53
• 4. 三批样品重现性53
• 5. 多西他赛pH敏感型脂质体理化性质的表征53-54
• 5.1 外观形态的观察53
• 5.2 粒径分布及Zeta电势的测定53-54
• 三、实验结果54-63
• 1. 制备方法考察结果54-55
• 2. 单因素考察结果55-61
• 2.1 药脂比55-56
• 2.2 胆固醇的量56-57
• 2.3 油酸的量57-58
• 2.4 水化温度58-59
• 2.5 水化时间59-60
• 2.6 水化体积60-61
• 3. 正交设计实验结果61-62
• 4. 重现性考察结果62
• 5. 多西他赛pH敏感型脂质体性质表征结果62-63
• 5.1 外观形态62-63
• 5.2 粒径分布和Zeta电势测定结果63
• 四、本章小结63-65
• 第三章 RGD介导的载多西他赛pH敏感脂质体的研究65-87
• 一、仪器与试剂65-66
• 1 仪器65
• 2. 药品与试剂65-66
• 二、实验方法66-71
• 1. RGD-PEG-LA的合成及表征66-69
• 1.1 RGD靶向因子的合成66-67
• 1.1.1 树脂溶胀活化66
• 1.1.2 天冬氨酸的连接66
• 1.1.3 脱保护(Fmoc)66
• 1.1.4 Kaiser检测66-67
• 1.1.5 甘氨酸的缩合67
• 1.1.6 精氨酸的缩合67
• 1.1.7 切割产物67
• 1.2 RGD-PEG的合成67-68
• 1.3 RGD-PEG-LA的合成68-69
• 2. 制备RGD修饰的主动靶向pH敏感型脂质体69
• 3. RGD介导的载DTX pH敏感型脂质体理化性质的表征69-70
• 3.1 外观形态的观察69
• 3.2 粒径分布及Zeta电势的测定69-70
• 4. 多西他赛体外释放实验HPLC方法的考察70-71
• 4.1 色谱条件70
• 4.2 不同pH缓冲液的配制70
• 4.3 精密度实验70
• 4.4 回收率实验70
• 4.5 不同pH缓冲液中标准曲线的绘制70-71
• 4.6 多帕菲(?)、DTX-PSL和RGD/DTX-PSL的体外释放71
• 4.6.1 多帕菲(?)的体外释放71
• 4.6.2 DTX-PSL、RGD/DTX-PSL的体外释放71
• 三、实验结果71-86
• 1. RGD-PEG-LA的合成及表征71-73
• 2. 制备RGD修饰的主动靶向pH敏感型脂质体73-74
• 3. RGD介导的载DTX pH敏感型脂质体理化性质74-75
• 3.1 外观形态74
• 3.2 粒径分布及Zeta电势74-75
• 4. 多西他赛体外释放实验HPLC方法的确立75-86
• 4.1 色谱条件75-76
• 4.2 精密度实验76-78
• 4.3 回收率实验78-80
• 4.4 不同pH缓冲液中标准曲线的绘制80-82
• 4.5 多帕菲(?)、DTX-PSL、RGD/DTX-PSL的体外释放82-86
• 4.5.1 多帕菲(?)的体外释放结果82-83
• 4.5.2 DTX-PSL、RGD/DTX-PSL的体外释放83-86
• 四、本章小结86-87
• 第四章 多西他赛pH敏感脂质体体内、外抗肿瘤效果研究87-103
• 一、仪器与试剂87-88
• 1. 仪器87
• 2. 药品与试剂87
• 3. 实验动物87-88
• 二、实验方法88-93
• 1. 细胞培养及肿瘤移植88-89
• 1.1 细胞复苏88
• 1.2 细胞换液与培养88
• 1.3 细胞计数与接种88-89
• 1.4 细胞冻存89
• 1.5 人乳腺癌模型的制作89
• 2. 细胞毒性实验89-91
• 2.1 空白脂质体对MCF-7细胞毒性实验90
• 2.2 多帕菲(?)、载药脂质体对MCF-7细胞毒性实验90-91
• 3. 细胞摄取实验91-92
• 3.1 定性细胞摄取实验91
• 3.2 定量细胞摄取实验91-92
• 4. 体内肿瘤靶向性实验92-93
• 4.1 NBD标记荧光切片实验92
• 4.2 荧光组织切片实验92-93
• 5. 抑瘤率实验93
• 三、实验结果93-101
• 1. 细胞毒性实验93-97
• 1.1 空白脂质体对MCF-7细胞毒性实验93-94
• 1.2 Duopafei(?)、载药脂质体对MCF-7细胞毒性实验94-97
• 2. 细胞摄取实验97-99
• 3. 荧光组织切片实验99-100
• 4. 抑瘤率实验100-101
• 四、本章小结101-103
• 第五章 多西他赛pH敏感脂质体的体内药动学研究103-116
• 一、仪器与试剂103
• 1. 仪器103
• 2. 药品与试剂103
• 3. 动物103
• 二、实验方法103-107
• 1. 血浆样品处理方法的建立103-104
• 2. 血浆样品测定方法的建立104-106
• 2.1 色谱条件104
• 2.2 方法专属性实验104
• 2.3 精密度实验104
• 2.4 方法提取回收率104-105
• 2.5 测定方法回收率105
• 2.6 标准曲线的建立105-106
• 2.6.1 溶液的配制105
• 2.6.2 标准曲线的绘制105-106
• 3. 多西他赛及制剂大鼠体内的药物动力学评价106-107
• 3.1 实验方法106
• 3.2 血药浓度的测定106
• 3.3 药代动力学参数的计算106-107
• 三、实验结果107-115
• 1. 血浆样品测定方法107-112
• 1.1 方法专属性107-108
• 1.2 精密度结果108-109
• 1.3 方法提取回收率109-110
• 1.4 测定方法回收率110-111
• 1.5 标准曲线绘制结果111-112
• 2. 多西他赛及制剂大鼠体内的药物动力学评价112-115
• 2.1 血药浓度测定结果112-113
• 2.2 药代动力学参数113-115
• 四、本章小结115-116
• 总结与展望116-119
• 参考文献119-127
• 致谢127-128
• 攻读学位期间发表的学术论文128-129
• 附件129

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