新型阳离子脂质体的制备及载运小干扰核酸能力的研究

发布时间：2017-04-17 03:05

  本文关键词：新型阳离子脂质体的制备及载运小干扰核酸能力的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：基因治疗是通过纠正或者沉默靶基因来治疗疾病的治疗方法,然而基因治疗的临床应用由于缺乏安全高效的基因递送载体而受到极大限制。因此,研发新型安全高效的基因递送载体成为了临床应用基因治疗的关键,其中阳离子脂质体成为载体研究的焦点之一。精胺是在真核细胞代谢中涉及的多胺并带有四价正电荷,可作为阳离子载体,但由于其分子量太小导致其无法高效的运载RNA或DNA进入细胞内。针对这一问题,本研究合成了五种较大分子量的新型精胺衍生物。随后将五种新型精胺衍生物与胆固醇(摩尔比为1:1)共用制备成阳离子精胺脂质体。并通过改变制备溶剂中乙醇的含量(体积比分别为50%,25%,12.5%),探讨了乙醇含量对精胺脂质体颗粒稳定性的影响。实验表明溶剂中乙醇含量为12.5%的精胺脂质体较其它浓度更为理想,即脂质体YY-1-12.5,YY-2-12.5,YY-3-12.5,YY-4-12.5,YY-5-12.5。本文对比了精胺脂质体包裹小干扰核酸(small interfering RNA,si RNA)前后粒径电位和形貌的变化,并选取lipofactamine 2000转染试剂作为阳性对照,从下面几个方面比较这五种脂质体的优劣:(1)通过测定五种精胺脂质体的包封率,分析五种精胺脂质体结合并包裹si RNA的能力;(2)通过细胞荧光转染试验,初步探讨这五种精胺脂质体是否可以运载si RNA进入细胞,以及转染效率;(3)通过靶基因敲低实验,进一步证明这五种精胺脂质体的转染效率以及释放效率;(4)测定五种精胺脂质体对细胞的毒性大小。结果表明,YY-1-12.5,YY-2-12.5,YY-3-12.5,YY-4-12.5,YY-5-12.5这五种精胺脂质体具有很强的包载si RNA的能力,可以安全高效的转染进入Hela细胞,有望成为新型安全高效的基因载体。
【关键词】：精胺 精胺衍生物 siRNA 脂质体
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 缩略词表11-12
• 第一章 绪论12-21
• 1.1 基因治疗现状12
• 1.2 基因载体的分类12-17
• 1.2.1 病毒基因载体12-13
• 1.2.2 非病毒基因载体13-17
• 1.3 脂质体构建的研究现状17-18
• 1.4 研究意义和研究内容18-21
• 1.4.1 研究意义18-19
• 1.4.2 研究内容19-21
• 第二章 精胺衍生物的合成21-35
• 2.1 引言21-22
• 2.2 实验试剂22-23
• 2.3 实验方法23-32
• 2.3.1 N,N'-二-(3-氨基-丙基)-N,N'-二9十八烯基- 1,4-丁二胺（化合物 1）的合成方法24-25
• 2.3.2 3-((3-氨基-丙基)-{4-[(3-氨基-丙基)-(2-十八碳9烯氧基羰基-乙基)-氨基]-丁基}-氨基)-丙酸9十八烯基酯（化合物 2）的合成方法25
• 2.3.3 9-十八烯酸 (3-氨基-丙基)-{4-[(3-氨基-丙基)-十八碳9烯酰-氨基]-丁基}-酰胺（化合物 3）的合成方法25-26
• 2.3.4 N, N'-二-(3-氨基-丙基)-N, N'-二-(3-十八碳9烯氧基-丙基)-1, 4-丁二胺（化合物 4）的合成方法26
• 2.3.5 N, N'-二-(3-氨基-丙基)-N, N'-二-(3-十八烷氧基-丙基)-1, 4-丁二胺（化合物5）的合成方法26-27
• 2.3.6 {3-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙基氨基)-丁基氨基]-丙基}-氨甲酸叔丁基酯（化合物 6）的合成方法27
• 2.3.7 1-溴9十八烯（化合物 7）的合成方法27-28
• 2.3.8 [3-({4-[(3-叔-丁氧基羰基氨基-丙基)9十八烯基-氨基]-丁基}9十八烯基-氨基)-丙基]-氨甲酸叔丁基酯（化合物 8）的合成28
• 2.3.9 丙烯酸9十八烯基酯（化合物 9）的合成28-29
• 2.3.10 3-((3-叔-丁氧基羰基氨基-丙基)-{4-[(3-叔-丁氧基羰基氨基-丙基)-(2-十八碳9烯氧基羰基-乙基)-氨基]-丁基}-氨基)-丙酸9十八碳烯基酯（化合物 10）的合成29
• 2.3.11 [3-({4-[(3-叔-丁氧基羰基氨基-丙基)-9 十八烯酰氨基]-丁基}9十八烯酰基)-丙基]-氨甲酸叔丁基酯（化合物 11）的合成29-30
• 2.3.12 1-[3- (9-十八烯氧基)]-丙醇（化合物 12）的合成30
• 2.3.13 1-(3-溴-丙氧基)9十八烯（化合物 13）的合成30-31
• 2.3.14 {3-[{4-[(3-叔-丁氧基羰基氨基-丙基)-(4-十七碳9烯氧基-丁基)-氨基]-丁基}-(3-十八碳9烯氧基-丙基)-氨基]-丙基}-氨甲酸叔丁基酯（化合物 14）的合成31
• 2.3.15 1-（3-十八烷氧基）-丙醇（化合物 15）的合成31-32
• 2.3.16 1-(3-溴-丙氧基)-十八烷(化合物 16)的合成32
• 2.3.17 {3-[{4-[(3-叔-丁氧基羰基氨基-丙基)-(4-十七烷氧基-丁基)-氨基]-丁基}-(3-十八烷氧基-丙基)-氨基]-丙基}-氨甲酸叔丁基酯(化合物 17)的合成32
• 2.4 实验结果与讨论32-34
• 2.5 本章小结34-35
• 第三章 精胺脂质体的制备与包封率测定35-52
• 3.1 引言35
• 3.2 实验仪器35-37
• 3.2.1 马尔文纳米粒度仪35-36
• 3.2.2 扫描电子显微镜36
• 3.2.3 荧光酶标仪36-37
• 3.3 实验方法37-40
• 3.3.1 精胺脂质体制备及包封率测定实验方法流程图37
• 3.3.2 精胺脂质体制备方法37-38
• 3.3.3 精胺脂质体包裹siRNA前后的粒径电位测量38-39
• 3.3.4 精胺脂质体包裹siRNA前后颗粒的形态表征39
• 3.3.5 精胺脂质体的包封率测定方法39-40
• 3.4 结果与讨论40-51
• 3.4.1 精胺脂质体制备结果与讨论40-41
• 3.4.2 精胺脂质体粒径及表面电位结果与讨论41-45
• 3.4.3 精胺脂质体形态表征结果与讨论45-48
• 3.4.4 精胺脂质体包封率结果与讨论48-51
• 3.5 本章小结51-52
• 第四章 精胺脂质体载运siRNA的体外细胞学评价52-67
• 4.1 引言52
• 4.2 实验试剂及耗材52-53
• 4.3 实验仪器53-54
• 4.3.1 倒置荧光显微镜53
• 4.3.2 实时荧光定量PCR仪53-54
• 4.4 实验方法54-59
• 4.4.1 精胺脂质体体外细胞学评价实验流程图54
• 4.4.2 细胞培养方法54-55
• 4.4.3 荧光转染实验方法55-56
• 4.4.4 靶基因敲低实验方法56-57
• 4.4.5 RNA提取方法（Omega试剂盒）57
• 4.4.6 反转录RT-PCR实验方法（Takara，，PrimeScript? RT试剂盒）57-58
• 4.4.7 RT-qPCR实验方法（Takara，PrimeScript? RT试剂盒）58-59
• 4.4.8 精胺脂质体的细胞毒性测定实验方法59
• 4.5 结果与讨论59-66
• 4.5.1 荧光转染实验结果与讨论59-63
• 4.5.2 靶基因敲低实验结果与讨论63-65
• 4.5.3 精胺脂质体细胞毒性测定65-66
• 4.6 本章小结66-67
• 总结与展望67-69
• 总结67-68
• 展望68-69
• 参考文献69-75
• 附录75-90
• 附录 175-76
• 附录 276-77
• 附录 377-78
• 附录 478-79
• 附录 579-80
• 附录 680-81
• 附录 781-82
• 附录 882-83
• 附录 983-84
• 附录 1084-85
• 附录 1185-86
• 附录 1286-87
• 附录 1387-88
• 附录 1488-89
• 附录 1589-90
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果90-91
• 致谢91-92
• 附件92

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 唐明青;刁勇;许瑞安;;以壳聚糖为载体的口服基因药物[J];中国生化药物杂志;2009年02期

2 张夏华;吴广通;李蓉;;基因治疗现状与前景[J];药学实践杂志;2009年01期

3 黄永焯;孙晓译;梁文权;;DNA/阳离子脂质体复合物的构效关系[J];中国药学杂志;2006年05期

  本文关键词：新型阳离子脂质体的制备及载运小干扰核酸能力的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：312254