EphB4受体对人胚胎神经干细胞增殖、分化的影响机理及药物莫诺苷的干预作用

发布时间：2017-04-18 08:19

  本文关键词：EphB4受体对人胚胎神经干细胞增殖、分化的影响机理及药物莫诺苷的干预作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：缺血性脑卒中损伤后期的神经再生修复是脑卒中康复治疗的关键。目前干细胞治疗是国际神经科学研究的热点和重点,脑卒中能刺激内源性神经干细胞的增殖短时间内跃迁,其潜在的机制受多条信号通路调控。基于神经血管单元的概念,本课题组2007年提出脑卒中等疾病治疗的“神经血管稳态重构”假说,希望通过给予外源性的药物或手段调节特异性的分子机制,增强脑损伤诱导的自体干细胞增殖及分化过程,最终促进神经血管稳态的重构。课题组前期研究提示,受体酪氨酸激酶Eph/ephrin信号通路可能参与了中药山茱萸的有效成份莫诺苷(morroniside)促神经发生的作用机制,该激酶家族的多个成员在细胞增殖和血管生成中有重要作用。本研究的目的是从分子水平探讨EphB4受体对人胚胎神经干细胞(human embryonic neural stem cells,NSCs)增殖、分化的影响机理,同时观察药物莫诺苷对体外培养的人胚胎神经干细胞增殖、分化的影响,探讨其通过增强神经发生治疗多种神经系统疾病的可能机制。研究采用体外培养的NSCs,分别在3天进行巢蛋白(nestin)免疫荧光染色,10天进行神经元(β-Ⅲtublin)、星形胶质细胞(GFAP)免疫荧光染色,16天进行少突胶质细胞(Galc)免疫荧光染色,激光共聚焦扫描图片进行NSCs鉴定。针对人EphB4基因构建3组短发卡RNA(sh RNA)慢病毒载体(携带绿色荧光蛋白(GFP)),对培养的NSC进行转染,采用实时荧光定量qRT-PCR(Real time quantitative PCR)和免疫蛋白印迹(Western blot)检测并筛选出干扰效果最好的shRNA慢病毒载体EPHB4-RNAi(28947-1)-1 sh RNA序列。同时,构建1组过表达人EphB4基因(overexpression,OE)慢病毒载体。分别采用qRT-PCR和Western blot两种方法检测转染效率。采用Ki67免疫荧光染色检测NSCs的增殖,nestin、β-Ⅲtublin、GFAP免疫荧光染色检测NSCs的分化,Hoechest33342/PI双染色法检测NSCs的凋亡。研究结果显示:(1)NSCs转染LV-sh RNA-EphB4后,EphB4mRNA和蛋白表达都显著减少(p0.001,p0.001);NSCs转染LVOE-Eph B4后,EphB4 mRNA和蛋白表达都显著增加(p0.05,p0.05),表明EphB4-shRNA和过表达慢病毒转染NSCs成功。(2)与其对照组相比,EphB4-sh RNA组Ki67+/GFP+、nestin+/GFP+、β-Ⅲtublin+/GFP+细胞均显著减少(p0.001,p0.001,p0.001),GFAP+/GFP+细胞显著增加(p0.001),细胞凋亡率显著增加(p0.05);与其对照组相比,Eph B4-OE组Ki67+/GFP+、nestin+/GFP+、β-Ⅲtublin+/GFP+细胞显著增加(p0.001,p0.01,p0.01),GFAP+/GFP+细胞显著减少(p0.001),细胞凋亡率显著减少(p0.01)。(3)转染LVshRNA-EphB4后给予药物莫诺苷(100μmol·L-1)作用48h,与单纯干扰组相比,Ki67+/GFP+、nestin+/GFP+、β-Ⅲtublin+/GFP+细胞显著增加(p0.001,p0.05,p0.001),细胞凋亡率显著减少(p0.05)。由此得出结论:EphB4基因的表达可以促进体外培养NSCs的增殖及神经元分化,降低细胞凋亡率,提示EphB4受体在神经干细胞增殖、分化中起到重要的作用;药物莫诺苷能显著促进NSCs的增殖以及向神经元方向的分化,且该作用机制不局限于EphB4信号通路。
【关键词】：人胚胎神经干细胞 Eph B4 短发卡RNA 过表达 莫诺苷 增殖 分化
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-14
• 材料与方法14-26
• 结果26-30
• 附图30-53
• 附表53-57
• 讨论57-61
• 参考文献61-67
• 结论67-68
• 综述 EphB/EphrinB信号通路对中枢神经功能的研究进展68-78
• 参考文献74-78
• 致谢78-79
• 个人简历79

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本文编号：314475