超声辐照联合紫杉醇对三维肿瘤球细胞毒性效果评价及其机制的研究

发布时间：2017-04-30 02:17

  本文关键词：超声辐照联合紫杉醇对三维肿瘤球细胞毒性效果评价及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的：目前抗癌药物的筛选,一般在检测体外单层细胞的药物敏感性实验中进行,但这些研究结果与患者体内实体肿瘤临床评估的药效存在一定偏差,产生这种差异的原因在于单层培养的细胞结构相对单一,不能模拟体内实体肿瘤的三维空间结构,无法真实反映体内肿瘤细胞的病理生理结构及状态,这造成体外单层细胞药物敏感性实验结果的临床参考意义受限。因此学者们致力于寻找一种新的实验模型,希望能有效弥补单层细胞模型所带来的不足。近年来,许多学者建立了三维(three-dimentional,3D)肿瘤球模型,普遍认为与二维(two-dimentional,2D)单层细胞相比,肿瘤球的生物学特性发生了明显变化：拥有乏氧微环境,化疗耐药性增加,更能反应体内恶性肿瘤的特性。3D肿瘤球模型具有诸多优点：①提供与体内肿瘤组织相类似的上皮细胞间的紧密联系；②拥有细胞外基质组分；③模拟了实体肿瘤从外到内的氧气、营养素、pH值和细胞增殖程度梯度递减的变化特点；④相关基因、蛋白的分子生物学表达更似体内肿瘤组织等。因此,以肿瘤球为实验模型的研究可能更具临床参考意义。目前肿瘤球常用的培养方法有：旋转瓶培养法、无血清悬浮培养法、悬滴法等,这些方法培养出的肿瘤球具有较强耐药性能,同时能模拟实体肿瘤乏氧微环境。其中无血清悬浮培养法可用于筛选多种肿瘤干细胞,研究表明肿瘤干细胞的存在是肿瘤产生化疗耐药、复发和转移的重要原因,因此本实验我们选择无血清悬浮培养法,拟建立能模拟体内肿瘤乏氧微环境,同时具备耐药性能的3D肿瘤球模型。超声靶向微泡破坏(ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD)技术是一种较具应用前景的靶向给药方法,通过在特定部位发射不同声强的超声波,致微泡破裂后产生空化效应、微流、冲击波、微射流等反应,在细胞表面形成可逆性小孔,即“声孔效应”,同时超声(ultrasound, US)辐照区域的“液体流动效应”等均可促进药物转运,从而增加靶细胞的药物摄取。UTMD技术在单层细胞中促进辐照区域药物、基因、蛋白等摄取的研究已被广泛报道,本课题组前期已开展UTMD技术在体外单层耐药细胞中逆转肿瘤多药耐药的相关研究,而目前UTMD技术辅助化疗药物应用于肿瘤球的报道甚少。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是广泛应用于乳腺癌、卵巢癌等多种不同类型癌症治疗的一线化疗药物。作为一种周期阻滞性药物,紫杉醇能有效杀死快速增殖的肿瘤细胞,它的作用机制是在细胞分裂时通过稳定微管结构,干扰微管解聚而使细胞周期阻滞于有丝分裂期,由于缺少有丝分裂这一重要的过程,细胞无法进行增殖,并最终诱导细胞死亡。已有研究表明UTMD技术能促进肿瘤细胞对包括紫杉醇在内的多种化疗药物的摄取,进而增加化疗药物对肿瘤细胞的毒性作用。综上所述,鉴于单层细胞培养模型在应用上的局限性,同时考虑到不同种类肿瘤细胞对超声的敏感性不同,为进一步考察超声辐照对不同种类肿瘤球的作用效果,本课题拟建立人乳腺癌MCF-7肿瘤球及人鼻咽癌5-8F肿瘤球模型,结合UTMD技术的生物学效应,进而探讨超声辐照辅助紫杉醇对不同肿瘤球的影响,并对其相关机制进行研究。材料与方法：1.建立3D肿瘤球模型人乳腺癌细胞MCF-7、人鼻咽癌细胞5-8F分别以含10%胎牛血清的DMEM及RPMI1640培养基进行培养。肿瘤球的培养是将经消化后的MCF-7、5-8F细胞重悬于含生长因子的无血清DMEM/F12培养基后,接种于6孔培养板,于37℃、5% CO2培养箱中进行孵育。2.3D肿瘤球和2D单层细胞的生物学性质差异检测2.1流式细胞周期检测收集处于对数生长期的MCF-7、5-8F中瘤球及单层细胞,经消化重悬成单细胞悬液,先后加入RNase A和PI各作用15 min,流式细胞仪定量检测各组的细胞周期差异。2.2荧光定量PCR检测3D肿瘤球与2D单层细胞的相关基因表达水平差异分别提取MCF-7、5-8F肿瘤球与单层细胞的RNA样品,经逆转录后,荧光定量PCR对耐药基因ABCB1、ABCG2、ABCC1,乏氧相关基因乏氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor, HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达情况进行检测。2.3 CCK-8法检测3D肿瘤球和2D单层细胞对紫杉醇的药物敏感性差异分别以不同浓度紫杉醇作用于MCF-7肿瘤球和MCF-7单层细胞、5-8F肿瘤球和5-8F单层细胞72 h后,CCK-8法测定各组的细胞相对存活率。3.脂质微泡的制备及理化性质鉴定按摩尔比称取一定量的DSPC、DPPE于三颈瓶中,加入PEG4000、泊洛沙姆(F188),并加25 mL蒸馏水,70℃水浴搅拌30 min,冷却至室温。把制好的脂质混悬液加入50 mL聚丙烯管内,将剪切刀头插至液面下,通入全氟丙烷气体2 min,以一定的剪切速度剪切一定时间,制得包裹全氟丙烷气体的脂质微泡(Microbubbles, MBs),分装于西林瓶中充入全氟丙烷气体密闭,并进行理化性质鉴定。4.超声辐照条件筛选在6孔培养板中分别种植MCF-7及5-8F肿瘤球,室温下经培养板底部分别对每区肿瘤球样品进行超声辐照。辐照参数采用正交设计方法,根据文献报道选定4因素,每因素3水平(占空比：10%,20%,50%；微泡浓度：10%,20%,30%；声强：0.21 W/cm2,0.65 W/cm2,1.09 W/cm2;辐照时间：30s,60s,90s)设计正交表L27(313),结合流式细胞仪检测细胞存活率及流式细胞仪检测细胞DiI摄取率两个观察指标,优化超声辐照参数。5.在优化的超声辐照条件下考察3D肿瘤球对紫杉醇的药物敏感性分别以(1)单独紫杉醇,(2)超声辐照联合紫杉醇作用于MCF-7、5-8F肿瘤球。紫杉醇终浓度分别为1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 ug/mL、2 ug/mL 3 ug/mL、4 ug/mL、5ug/mL,每个浓度设置4个复孔,孵育72 h后CCK-8法测定各组的细胞相对存活率。6.优化的超声辐照条件下检测3D肿瘤球对DiI的摄取情况分别设置MCF-7、5-8F肿瘤球的(1)空白对照组,(2)DiI组,(3)超声辐照+DiI组,运用上述所筛选出优化的超声辐照参数作用于MCF-7、5-8F肿瘤球,随后加入等量DiI,所有样品孵育24 h后,流式细胞仪定量分析各组的DiI荧光摄取量。7.检测3D肿瘤球的细胞间隙及乏氧差异7.1 HE染色法(石蜡切片)：分别将处于对数生长期的MCF-7、5-8F肿瘤球用PBS漂洗2遍,4%多聚甲醛固定1.5 h,常规脱水,石蜡包埋,切片,脱蜡染色,封片,镜下观察。7.2荧光定量PCR检测MCF-7、5-8F肿瘤球的HIF-1α mRNA表达差异,方法同上。8. Western blot检测超声辐照对3D肿瘤球相关蛋白表达的影响分别提取未接受超声辐照、超声辐照后24 h、48 h、72 h的MCF-7、5-8F肿瘤球蛋白样品各四组,western blot分析超声辐照后耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp/ABCB1)、乳腺癌耐药相关蛋白(breast cancer resistant protein, BCRP/ABCG2)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein 1, MRP1/ABCC1),乏氧相关蛋白HIF-1α、VEGF,DNA损伤指标γ-H2AX蛋白的表达情况。9.统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,所有数据均以x±s表示。设计4因素3水平正交表,并按正交设计资料的方差分析对所得数据进行统计分析；本实验余数据比较均采用两独立样本t检验进行统计分析；将P0.05设为差异性检验水准,定义*为P0.05,**为P0.01,***为P0.001。结果：1.3D肿瘤球模型的成功建立MCF-7细胞和5-8F细胞均能在无血清的肿瘤球培养基中形成肿瘤球,根据两种细胞生长速度上的差异分别选取培养了15 d (MCF-7)、7d (5-8F)的肿瘤球作为实验对象。2.3D肿瘤球和2D单层细胞的生物学性质差异检测2.1流式细胞周期检测与单层细胞相比,MCF-7、5-8F肿瘤球的G1期细胞比例均增多,S期和G2/M期细胞比例均减少,差异均具统计学意义(P0.05)。提示两种肿瘤球处于相对静息期。2.2荧光定量PCR检测3D肿瘤球与2D单层细胞的相关基因表达水平差异与MCF-7单层细胞相比, MCF-7肿瘤球的ABCB1、ABCG2、HIF-1α、VEGF在mRNA水平上的表达分别为前者的4.87倍、2.53倍、2.08倍、2.56倍,差异均具统计学意义(P0.05)。相较5-8F单层细胞,在mRNA水平上5-8F肿瘤球的ABCG2、ABCC1、HIF-1α、VEGF表达分别为前者的3.46倍、1.49倍、4.05倍、2.22倍,其中除ABCCl外差异均具统计学意义(P0.05)。提示成功建立了相对耐药、拥有乏氧微环境的3D肿瘤球模型。2.3 CCK-8法检测3D肿瘤球和2D单层细胞对紫杉醇的药物敏感性差异与单层细胞相比,无论是MCF-7或5-8F成球后均提高了对紫杉醇的耐药性,紫杉醇的杀伤效果明显减弱,差异具统计学意义(P0.05)。3.脂质微泡的理化性质普通光学显微镜下观察：制备得到的脂质体微泡外观圆整,分布均匀,无明显聚集现象。库尔特计数仪测得MBs浓度约为(3.93±1.0)×108个/mL,粒径为(2.03±0.93)μm。4.超声辐照条件筛选设计正交实验筛选合适的超声辐照参数,结合各组细胞存活率及DiI摄取率两个指标确定超声辐照各因素各水平的主次关系,分别选取占空比10%、微泡浓度10%、辐照时间60s及声强0.65 W/cm2为MCF-7肿瘤球的适宜超声辐照参数；对于5-8F肿瘤球,选取占空比20%、微泡浓度10%、辐照时间90s及声强0.65 W/cm2为其适宜超声辐照参数。5.在优化的超声辐照条件下考察3D肿瘤球对紫杉醇的药物敏感性在相同的紫杉醇浓度作用下,当紫杉醇浓度处于相对低剂量(MCF-7肿瘤球：1 ng/mL;5-8F肿瘤球：2 ng/mL)时,超声辐照联合紫杉醇作用组和单独紫杉醇作用组对MCF-7或5-8F肿瘤球的细胞毒性作用无显著差异(P0.05);当紫杉醇浓度处于相对高剂量(MCF-7肿瘤球：1 ng/mL；5-8F肿瘤球：2ng/mL)时,超声辐照联合紫杉醇作用组对MCF-7和5-8F肿瘤球均显示出较好的杀伤效果,细胞存活率均明显低于各自的单独紫杉醇作用组(P0.05),提示适宜的超声辐照条件可增强一定浓度范围内紫杉醇对MCF-7和5-8F肿瘤球的药物毒性作用。6.优化的超声辐照条件下检测3D肿瘤球对DiI的摄取情况优化的超声参数辐照均能促进MCF-7、5-8F肿瘤球对DiI摄取,MCF-7肿瘤球的促进幅度明显高于5-8F肿瘤球(2.1倍VS 1.53倍),与上述CCK-8结果相符。提示超声辐照可以增加肿瘤球细胞内的药物摄取。7.检测3D肿瘤球的细胞间隙及乏氧差异7.1 HE结果显示MCF-7肿瘤球细胞间隙较5-8F肿瘤球宽,肿瘤球内细胞排列相对松散,后者球体结构紧凑,细胞排列紧密。7.2肿瘤球HIF-1α mRNA表达差异：Q-PCR结果显示5-8F肿瘤球HIF-1α的表达水平为MCF-7肿瘤球的1.48倍,差异具统计学意义(P0.001)。这种差异的存在可能是因为两种肿瘤球内部的细胞间隙大小不一,超声辐照使氧气更易进入间隙较大的MCF-7肿瘤球内部,相对的高氧环境造成MCF-7肿瘤球HIF-1α mRNA的低表达。8. Western blot检测超声辐照对3D肿瘤球相关蛋白表达的影响与无超声作用的空白对照组相比,超声作用后5-8F肿瘤球P-gp、BCRP、 MRP1、VEGF随时间延长表达量出现下调,HIF-1α表达量未见明显变化；MCF-7肿瘤球在超声辐照后P-gp随时间延长而表达量少许增加,BCRP、MRP1、HIF-1α、 VEGF的表达量均未见明显变化。提示不同种类肿瘤球蛋白表达对超声辐照的响应存在差异,超声辐照可以下调5-8F肿瘤球部分耐药、乏氧相关蛋白的表达水平。9.DNA损伤指标检测对MCF-7和5-8F肿瘤球,均在超声辐照72 h后检测到γ-H2AX蛋白表达量明显上调,提示超声辐照可引起肿瘤球的DNA损伤,并可能进一步影响细胞增殖及相关基因、蛋白的表达。结论1.促进不同种类肿瘤球紫杉醇摄取的最佳超声辐照参数不同；2.超声辐照可促进紫杉醇对肿瘤球的细胞毒性作用；3.超声辐照促进紫杉醇对肿瘤球细胞毒性作用的主要机制可能是：①声孔效应增加细胞膜的通透性；②辐照区域产生的液体流动效应和肿瘤球细胞间隙差异影响紫杉醇对肿瘤球内部区域的渗透；③降低部分耐药、乏氧相关蛋白的表达;④诱导DNA损伤。4.超声辐照对于不同种类肿瘤球的影响机制存在差异。
【关键词】：超声辐照 肿瘤球 微泡 紫杉醇
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-27
• 参考文献24-27
• 第一章 建立三维肿瘤球模型及优化超声辐照参数27-50
• 1. 实验材料27-29
• 2. 实验方法29-36
• 3. 实验结果36-46
• 4. 讨论46-48
• 参考文献48-50
• 第二章 超声辐照辅助增加紫杉醇对三维肿瘤球细胞毒性实验的相关机制研究50-65
• 1. 实验材料50-51
• 2. 实验方法51-55
• 3. 实验结果55-59
• 4. 讨论59-62
• 结论62-63
• 参考文献63-65
• 缩略词65-66
• 成果66-67
• 附录67-68
• 致谢68-69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈智毅;谢明星;;超声靶向破坏微泡技术的应用进展[J];中国医学影像技术;2010年09期

  本文关键词：超声辐照联合紫杉醇对三维肿瘤球细胞毒性效果评价及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：336072