乙酰普鲁兰叶酸偶合体纳米粒的体外细胞摄取途径研究

发布时间：2017-05-01 01:00

  本文关键词：乙酰普鲁兰叶酸偶合体纳米粒的体外细胞摄取途径研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景随着纳米技术的飞速发展,越来越多的纳米材料如纳米粒、脂质体以及高分子聚合物-药物偶联体等用于抗肿瘤药物载体的研究及临床应用,并显示了良好的应用前景。普鲁兰多糖(Pullulan)是一种水溶性的中性直链多糖,由α-1,6糖苷键连接的麦芽三糖重复单位组成。由于无毒、无免疫原性、无致突变作用、无致癌性以及良好的生物相容性等优良特点,近年来作为靶向药物或基因载体受到广泛关注。课题组前期合成并制备了乙酰普鲁兰叶酸偶合的纳米粒(Folate conjugated pullulan acetate,FPA NPs),研究结果表明具有较高的药物包封率,体内外缓释特性,且具有良好的体内生物相容性。但是作为靶向抗肿瘤药物载体,其细胞摄取机制还有待进一步研究。目的1.制备载药的FPA NPs。选择三种叶酸受体表达量不同的肿瘤细胞,研究其体外抑瘤效应;并从细胞水平阐明摄取纳米粒的途径和机制。2.研究大鼠肝脏枯否细胞(Kupffer cells,KC)摄取纳米粒子途径及初步阐述免疫逃逸机制,进一步评价其作为靶向抗肿瘤药物载体的可行性。方法1.透析法制备包载表阿霉素的(Epirubicin,EPI)纳米粒(FPA/EPI NPs)。采用激光粒度分析仪检测粒径分布、表面Zeta电位等,透射电镜下观察纳米粒的形貌;考察其载药率、包封率及体外释药行为。2.选择叶酸受体高表达细胞株Hela细胞,叶酸受体低表达细胞株MCF-7细胞及叶酸受体阴性细胞株HepG2细胞,MTS法检测FPA NPs和FPA/EPI NPs体外细胞毒。通过加入4种特异性细胞吞噬抑制剂氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ),氯喹(chloroquine,CQ),阿米洛利(Amiloride,AMR),制霉素(Nystain,NY)和叶酸(folicacid,fol),通过激光共聚焦、流式细胞分析仪和荧光化学发光仪检测细胞内荧光强度,定性定量分析纳米粒摄取量和摄取途径。3.肝脏灌流消化及梯度离心法提取sd大鼠肝脏枯否细胞(kupffercell,kc)并鉴定。研究4种选择性吞噬抑制剂和叶酸对kc摄取纳米粒的影响;并通过elisa方法检测4种吞噬抑制剂和nf-?b通道抑制剂pdtc对kc摄取纳米粒后,炎症因子tnf-α,il-1β,il-6分泌量的影响。结果1.透析法制备了fpa/epinps,透射电镜下观察到纳米粒呈圆球形,粒径分布均匀。粒径分析仪测试fpanps和fpa/epinps粒径分别为(204.2±10.9)nm和(273.4±11.0)nm。fpa/epinps载药量和包封率分别为(6.45±1.04)%和(72.45±11.50)%。体外释放结果表明前12h药物释放较快,之后药物缓慢释放。2.mts法测定hela,mcf-7,hepg2细胞分别与不同浓度的fpanps孵育时,细胞存活率高,表明三种细胞无显著的细胞毒性。此外,激光共聚焦显微镜结果表明fpa/epinps较容易进入叶酸高表达细胞株hela细胞。对于hepg2细胞,fpa/epinps主要通过网格蛋白介导的内吞以及巨胞饮途径进入细胞。对于hela细胞和mcf-7细胞,叶酸抑制纳米粒的摄取量,其纳米粒摄取量分别减少到原来57.8%和70.0%。3.通过肝脏灌流消化及梯度离心法成功提取了kc,溶酶体抑制剂cq显著抑制kc摄取纳米粒的量;cq和nf-?b通道抑制剂pdtc联用,显著降低了炎症因子tnf-a,il-1β和il-6的分泌量(***p0.001)。结论1.成功制备了fpa/epinps,纳米粒具有较高的药物包封率和良好的药物缓释性。2.体外细胞毒实验表明该载体材料无毒。对于叶酸高表达细胞株,载药纳米粒具有显著抑瘤效应,并显著增加了细胞摄取量。网格蛋白介导的内吞以及巨胞饮途径等多种机制参与了fpa/epinps进入细胞的途径,但是对于叶酸高表达的hela细胞,叶酸受体介导的途径占主导作用。3.溶酶体抑制剂CQ显著抑制KC摄取纳米粒,CQ和PDTC联用能显著抑制KC分泌三种炎症因子。4.综上所述,对于叶酸高表达细胞株,FPA NPs包载抗肿瘤药物EPI,能显著增加细胞摄取并具有显著的抑瘤效应,作为靶向抗肿瘤药物载体,具有良好的开发应用前景。
【关键词】：普鲁兰多糖 叶酸 纳米粒 靶向抗肿瘤 枯否细胞 细胞摄取
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-25
• 结果25-36
• 讨论36-39
• 小结39-40
• 参考文献40-44
• 综述：普鲁兰多糖纳米粒作为靶向抗肿瘤药物载体的研究进展44-55
• 参考文献50-55
• 附录55-56
• 攻读学位期间发表文章情况56-57
• 致谢57-58
• 个人简历58

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本文编号：337885