具有肝实质细胞线粒体靶向功能的纳米递释系统的研究

发布时间：2017-05-04 15:04

  本文关键词：具有肝实质细胞线粒体靶向功能的纳米递释系统的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：恶性肿瘤的防治始终是生命科学研究领域的一个难点。本论文根据肿瘤局部和线粒体的生理特点要求,设计了两种新型的多功能高分子材料N-甘草次酸-酸敏感桥-聚乙二醇-壳聚糖衍生物(N-glycyrrhetinic acid(GA)-polyethylene glycol(PEG)-chitosanderivatives,NGPC)和N-季铵-壳聚糖衍生物(N-quaternary ammonium-chitosanderivatives,NQC),并以此为构筑单元,以马钱子碱(Brucine)为模型药物,构建新型多功能纳米药物递释系统(MNPs)。在该系统中,聚乙二醇具有较长的亲水链,可以在纳米粒周围形成水化层,减少血液中巨噬细胞的吞噬,延长递释系统在体内循环时间,同时对季铵正离子起屏蔽作用,减少其在生理环境中的毒性。水化层表面的甘草次酸具有肝实质细胞主动靶向的功能,当载体系统被内吞进入到肝细胞的内涵体/溶酶体后,由于微环境pH值的降低,纳米粒表面的水化层随着GA-PEG脱落而消失,裸露出带季铵正离子的正电荷壳聚糖纳米粒,同时亚胺基团产生强烈的质子海绵效应,逃逸出溶酶体,通过正负电荷的吸引浓集于线粒体表面,释放出药物,抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。在课题组前期研究的基础上,本课题首先用离子交联法制备了载马钱子碱的壳聚糖多功能释系统(Brucine/MNPs),以及分别由NGPC和NQC为构筑材料制备的参比制剂(Brucine/NGPC-NPs和Brucine/NQC-NPs),对其外观形态、粒径分布、Zeta电位、包封率、载药量、水化层厚度、体外释放及质子海绵效应等理化性质进行了详细考察。结果显示,Brucine/MNPs的包封率为68.53±2.42%,载药量为6.01±0.27%,粒径为185.3±6.9nm,并且Brucine/MNPs保持着与空白MNPs相当的pH响应的电荷翻转能力和内体逃逸能力,透射电镜照片下观察Brucine/MNPs为球形,分散较好,与纳米粒径仪测定粒径基本相当。体外释放表明,Brucine/MNPs在pH7.4和pH4.5下的释放行为基本一致,都具有缓释作用。以溶液剂和Brucine/NQC-NPs作为参比制剂,对Brucine/NGPC-NPs和iibrucine/mnps在小鼠体内的组织分布行为进行了考察,以相对摄取率(relativeratio,re)和峰浓度比(concentrationratio,ce)等为评价指标,评价其对肝组织的靶向性。研究结果显示,brucine/ngpc-nps和brucine/mnps具有较强的肝靶向性,以auc0-t计算,二者的re值分别是brucine/nqc-nps的4.89倍和5.02倍,ce值分别是brucine/nqc-nps的2.49倍和2.57倍,其肝靶向效率和相对靶向效率也都显著提高,具有较强的肝组织选择性。以人肝癌hepg2细胞为细胞模型,考察浓度、时间、温度对其细胞摄取的影响,并对其细胞摄取机制进行初步探讨。结果发现,hepg2细胞对各制剂的摄取均具有时间和浓度依赖性,且对brucine/ngpc-nps和brucine/mnps的摄取明显强于brucine/nqc-nps和brucinesolution。为了进一步研究其被细胞内化的机制,考察甘草次酸和各种内吞抑制剂对细胞摄取的影响,发现hepg2细胞对brucine/mnps的摄取过程需要转运蛋白的参与,且主要通过表面的甘草次酸配体与肝细胞表面的甘草次酸受体结合的方式来增加在靶细胞的浓集,之后通过网格蛋白介导的内吞路径被细胞内化进入细胞内涵体/溶酶体。采用激光共聚焦显微镜定性观察brucine/ngpc-nps、brucine/nqc-nps和brucine/mnps在细胞内的转运过程,并结合hplc检测hepg2细胞线粒体内brucine的累积量,定量考察brucine/mnps的线粒体靶向作用。研究表明,与ngpc-nps和nqc-nps相比,mnps具有显著的内涵体/溶酶体逃逸能力和线粒体靶向作用。考察了四种brucine制剂的体外抗肿瘤活性,并对其促肿瘤细胞凋亡机制进行了初步探讨,结果表明,在各给药浓度下,载药纳米制剂均表现出了较强的杀死肿瘤细胞的能力,且brucine/mnps明显强于其它制剂,细胞总凋亡率增加,结合透射电镜观察和流式细胞仪发现,线粒体出现了明显的肿胀和变形,并伴随着线粒体膜电位的降低和细胞色素c的释放,且载体的引入并没有改变细胞周期的变化,细胞周期仍被阻滞在g2期。上述结果表明,多功能纳米载药系统不仅能够促进肿瘤细胞的摄取,还能有效地实现药物的细胞内转运,促进肿瘤细胞的凋亡,增强药物对肿瘤细胞的杀伤力。建立heps异位荷瘤小鼠模型,考察mnps的体内抗肿瘤药效学,结果显示,brucine/mnps在有效抑制肿瘤生长的同时,可以显著延长荷瘤小鼠的生存时间,肿瘤组织病理切片显示,经brucine/mnps治疗后,肿瘤坏死面积最大,凋亡细胞占细胞总数的比例增加,Cleaved caspase-3活化检测结果表明相较于其它组,Brucine/MNPs组有大量的Cleaved caspase-3蛋白表达,进而活化一系列与细胞凋亡相关的酶,导致更多的肿瘤细胞凋亡,发挥更强的抗肿瘤效应。本论文构建的智能型线粒体靶向纳米载药系统,针对肝组织细胞的表面特性和肿瘤细胞微环境pH的变化,发生了在体的高度响应,增加了药物在肝组织的蓄积和肝肿瘤细胞的摄取,实现了药物在细胞内的有效传递和线粒体的定位释放,抑制了肿瘤细胞的生长,提高了抗肿瘤效果,降低了有毒性中药抗肿瘤有效成分的毒副作用,为线粒体靶点药物提供了安全、高效的载体平台,同时也为线粒体靶向药物递释系统的构建提供了有益的借鉴。
【关键词】：分级逐次 pH响应 线粒体靶向 抗肿瘤 马钱子碱
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-16
• 绪论16-18
• 第一章 文献研究18-34
• 1.1 线粒体靶向的研究意义18-19
• 1.2 实现线粒体靶向的策略19-23
• 1.2.1 基于亲脂性阳离子的线粒体靶向策略19-21
• 1.2.2 基于线粒体靶向信号肽和细胞穿膜肽的线粒体靶向策略21-23
• 1.3 马钱子碱抗肿瘤作用研究进展23-24
• 1.4 本论文的设计思路24-26
• 参考文献26-34
• 第二章 多功能纳米粒递药系统的制备及表征34-44
• 2.1 材料与仪器34-35
• 2.1.1 试药与试剂34
• 2.1.2 仪器34-35
• 2.2 实验方法与结果35-40
• 2.2.1 CTS-NPs的制备35
• 2.2.2 CTS-NPs理化性质的研究35-40
• 2.2.2.1 Brucine/CTS-NPs的粒径、包封率及载药量的测定35-36
• 2.2.2.2 外观形态观察36-37
• 2.2.2.3 水化层厚度的测定37-38
• 2.2.2.4 p H对MNPs电位的影响38
• 2.2.2.5 纳米粒的质子缓冲能力38-40
• 2.2.2.6 体外释放40
• 2.3 小结40-41
• 参考文献41-44
• 第三章 多功能纳米递药系统的肝组织靶向性研究44-62
• 3.1 材料与仪器44-45
• 3.1.1 试药与试剂44
• 3.1.2 仪器44-45
• 3.1.3 实验动物45
• 3.2 实验方法与结果45-60
• 3.2.1 马钱子碱体内组织分析方法的建立45-53
• 3.2.1.1 UHPLC-MS/MS条件45-46
• 3.2.1.2 小鼠血浆样品和组织样品处理方法46
• 3.2.1.3 方法专属性考察46-47
• 3.2.1.4 标准曲线的建立47-48
• 3.2.1.5 绝对回收率48-49
• 3.2.1.6 相对回收率49-50
• 3.2.1.7 日内日间精密度50-51
• 3.2.1.8 样品冻融及放置稳定性考察51-53
• 3.2.2 马钱子碱各制剂在小鼠体内的组织分布研究53-60
• 3.2.2.1 给药方案53-55
• 3.2.2.2 靶向指标评价55-60
• 3.3 小结60
• 参考文献60-62
• 第四章 多功能纳米递药系统体外细胞转运行为研究62-80
• 4.1 材料与仪器62-63
• 4.1.1 试药与试剂62
• 4.1.2 仪器62-63
• 4.1.3 细胞63
• 4.2 实验方法与结果63-78
• 4.2.1 马钱子碱（Brucine）体外细胞分析方法的建立63-67
• 4.2.1.1 色谱条件63
• 4.2.1.2 细胞样品处理方法63
• 4.2.1.3 方法专属性考察63-64
• 4.2.1.4 标准曲线的建立64-65
• 4.2.1.5 准确度和精密度65-66
• 4.2.1.6 提取回收率66
• 4.2.1.7 样品冻融及放置稳定性考察66-67
• 4.2.2 细胞培养67
• 4.2.3 Hep G2细胞中马钱子碱含量的测定67
• 4.2.4 Hep G2细胞中蛋白含量的测定67-68
• 4.2.5 药物作用时间对Hep G2细胞摄取的影响68-69
• 4.2.6 药物浓度对Hep G2细胞摄取的影响69-70
• 4.2.7 温度对细胞摄取的影响70-71
• 4.2.8 甘草次酸对细胞摄取的影响71-72
• 4.2.9 内吞抑制剂对细胞摄取的影响72-73
• 4.2.10 荧光探针载体细胞内转运示踪73-75
• 4.2.11 线粒体靶向定性观察75-77
• 4.2.12 药物在线粒体中的分布77-78
• 4.3 小结78
• 参考文献78-80
• 第五章 多功能纳米递药系统体外细胞抗肿瘤活性研究80-100
• 5.1 材料与仪器80-81
• 5.1.1 试药与试剂80
• 5.1.2 仪器80-81
• 5.1.3 细胞81
• 5.2 方法与结果81-96
• 5.2.1 细胞毒性评价81-82
• 5.2.2 载药纳米粒的细胞毒性评价82-83
• 5.2.3 载药纳米粒促细胞凋亡初步评价83-91
• 5.2.3.1 普通光镜观察84-85
• 5.2.3.2 高内涵细胞分析系统观察细胞核的变化85-86
• 5.2.3.3 透射电镜观察细胞超微结构的变化86-87
• 5.2.3.4 Annexin V-FITC细胞凋亡率检测87-89
• 5.2.3.5 流式细胞仪检测细胞周期89-91
• 5.2.4 线粒体凋亡途径机制研究91-96
• 5.2.4.1 线粒体膜电位△Ψm的测定91-93
• 5.2.4.2 Cyt.c释放的测定93-96
• 5.3 小结96
• 参考文献96-100
• 第六章 多功能纳米递药系统体内抗肿瘤药效学研究100-112
• 6.1 材料与仪器100-101
• 6.1.1 试药与试剂100
• 6.1.2 仪器100-101
• 6.1.3 实验动物101
• 6.1.4 瘤株101
• 6.2 试验方法与结果101-109
• 6.2.1 异位荷瘤小鼠模型的建立101
• 6.2.2 给药方案101
• 6.2.3 抑瘤效果评价101-102
• 6.2.4 肿瘤体重考察102-103
• 6.2.5 生存期考察103-104
• 6.2.6 肿瘤组织病理学考察104-109
• 6.2.6.1 苏木素一伊红（H&E）染色形态学观察104-106
• 6.2.6.2 TUNEL凋亡实验106-107
• 6.2.6.3 Cleaved caspase-3 的检测107-109
• 6.3 小结109
• 参考文献109-112
• 结论与展望112-116
• 1. 全文总结112-113
• 2. 本课题的创新之处113
• 3. 展望113-116
• 致谢116-118
• 攻读学位期间发表的学术论文目录118-119

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