人环核苷酸磷酸二酯酶4抑制剂高通量筛选系统的建立

发布时间：2017-05-14 16:25

  本文关键词：人环核苷酸磷酸二酯酶4抑制剂高通量筛选系统的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人环核苷酸磷酸二酯酶同工酶选择性抑制剂有药用潜力。酶抑制剂可来自合理设计或组合库。现有高通量筛选方法能够降低从组合库发现酶抑制剂的成本而提高效率,但要求样品纯度大于80%。本实验室已建立碱性磷酸酶偶联孔雀绿定磷法测定环核苷酸磷酸二酯酶活性方法,及基于竞争结合、磁分离靶蛋白-配体复合物高通量筛选配体混合物的方法。本项目建立基于微孔板高通量筛选纯化环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂的方法,并考察筛选配体混合库所需靶蛋白固定化方法。孔雀绿定磷法受高浓度变性蛋白干扰,用微孔板定磷法测定PDE活性无法离心去除变性蛋白。实验发现终浓度小于30 mg/L蛋白对孔雀绿定磷无干扰,这就要求基于孔雀绿定磷法高通量筛选PDE抑制剂时靶酶比活性高于0.008 kU/g。全长人环核苷酸磷酸二酯酶4 (hPDE4)和截短突变体(152aa-528aa)编码序列分别连接到含6His-SUMO原核表达载体pReceiver-13,转化大肠杆菌进行诱导表达；用Ni-NTA 琼脂糖柱纯化。所得全长人PDE4比活大于0.017 kU/g而截短突变体大于0.05 kU/g,可用于微孔板基于孔雀绿定磷高通量筛选纯化候选抑制剂库。用Biotek ELX800酶标仪测定了两种PDE4对cAMP、罂粟碱(PAP)、rolipram的亲和性,发现结果与用光度计常规测定结果一致。可见,基于微孔板和孔雀绿定磷可高通量筛选纯化磷酸二酯酶抑制剂库。Rolipram是人环核苷酸磷酸二酯酶的经典抑制剂；文献报道苯甲酰胺类与其结构相似化合物对猪主动脉PDE4有很强抑制作用,但未报道对hPDE4是否也有强抑制作用。异香草醛烷基化、氧化以及和氨基化合物酰胺化,合成一系列苯甲酰胺类化合物候选抑制剂,用HPLC确认纯度都高于80%。用所建立高通量方法测定了该类化合物对全长hPDE4的亲和力,发现该类化合物对全长hPDE4仍有较强抑制活性,但抑制剂的结构-活性关系明显不同于用猪主动脉PDE4为靶酶。用酶抑制剂混合物为库成分筛选抑制剂要求将靶蛋白固定化在磁珠表面且保留活性。Ni2+ -NTA磁珠或双砜磁珠能固定化6His融合表达靶蛋白。Ni2+ -NTA磁珠易制备且固定化反应快,但其固定化产物在pH8.0时稳定而测定配体亲和力适合用pH 7.4,且pH值可能影响配体对靶酶亲和力。在pH 8.0和pH 7.4时抑制剂对hPDE4亲和力有明显差异；6His标签融合表达大肠杆菌碱性磷酸酶与Ni2+ -NTA磁珠结合后,在pH 7.4时3h内固定化酶解离不超过6%,适合从竞争结合反应体系回收90%以上靶蛋白-配体复合物；6His-hPDE4截短突变体与Ni2+ -NTA磁珠结合后在pH 7.4时稳定性相当；经Ni2+ -NTA磁珠和双砜磁珠位点选择性固定化的6His标签融合酶都能保留90%以上活性,但双砜磁珠固定靶酶会引起非特异性吸附且固定化反应速度很慢。因此,Ni2+ -NTA磁珠固定化靶蛋白有望用于筛选混合物为库成分的配体组合库。
【关键词】：环核苷酸磷酸二酯酶4 高通量筛选 苯甲酰胺类 磁珠
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 第一部分 磷酸二酯酶4的重组表达和纯样品配体高通量筛选系统的建立14-24
• 1 实验材料14-15
• 2 实验方法15-23
• 3 讨论23-24
• 第二部分 苯甲酰胺类对hPDE4抑制作用的再评价24-30
• 1 实验材料24-25
• 2 实验方法25-26
• 3 结果26-29
• 4 讨论29-30
• 第三部分 混合物配体筛选的固定化方案30-47
• 1 实验材料30-31
• 2 实验方法31-40
• 3 结果40-46
• 4 讨论46-47
• 全文总结47-48
• 参考文献48-52
• 文献综述52-60
• 参考文献56-60
• 致谢60-61
• 攻读硕士学位期间发表的论文61

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