肝素钠中主要杂质的NMR定量分析方法及污染肝素的分离技术研究

发布时间：2017-05-14 17:00

  本文关键词：肝素钠中主要杂质的NMR定量分析方法及污染肝素的分离技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝素钠（Heparin Sodium，HP）是从猪小肠粘膜中提取出来的一种糖胺聚糖类抗凝血药物，具有抗凝血和抗血栓形成的功能，还有抗炎、抗过敏、抑制平滑肌细胞增殖、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学功能，是需要迅速达到抗凝作用的首选药物，在临床上得到广泛应用。 在2008年初，美国、欧洲等多个国家发生了严重的肝素钠注射液不良反应事件，引发数百例病人产生严重的过敏反应，甚至导致了约百例病人死亡。肝素钠事件在世界范围内引起了广泛的探讨与研究，FDA分析结果表明：该事件与肝素钠中存在的污染物多硫酸软骨素（Oversulfated Chondroitin Sulfate，OSCS）有关。OSCS具有和肝素钠相似的结构、相对分子量范围，常规的生物化学方法难以对其进行检测。为了加强该类原料质量监督，建立一种快速有效的检测HP中OSCS的方法十分重要。常规的1H-NMR虽可用于两者的检测，但存在检出限（Limit of detection，LOD）、定量检测限（Limit of quantitation，LOQ）高的缺点。 本文优化了1H-NMR法检测HP中的OSCS的实验仪器条件：样品浓度25mg/mL，定标物TSP含量为0.020%（W/V），样品旋转为10Hz，窗函数线宽因子Lb为1.00Hz，采样脉冲序列PULPROG为zg，驰豫延迟时间D1为4.00s，在此实验条件另外，LOD为0.01%，比文献报道提高了10倍。应用峰高法和峰面积法对HP中杂质OSCS进行了定量计算，结果表明峰高法的LOQ为0.1%，比文献报道提高了5倍。 污染肝素的分离纯化技术可使已污染肝素的价值回归。同时，肝素钠中污染物OSCS的来源研究对以后肝素钠的生产具有重要意义。 利用阴离子树脂交换法分离肝素钠与OSCS的研究。根据HP与OSCS的电荷数的不同，以离子交换法对两者进行分离，采用单因素试验研究了树脂型号、树脂用量等因素对两者分离度的影响，，最优结果为：树脂型号FBD202，树脂用量20%，吸附时间4h，吸附PH9.5，吸附温度55℃，盐浓度15%。分离度达75%以上。 对肝素钠中污染物OSCS来源的研究。从肝素钠的主要原料猪小肠着手，将猪小肠分离为三部分（肠粘膜、肠衣、浆膜），分别进行粘多糖组成分析，结果表明：三者均不含有OSCS，肠粘膜中主要成分是HP，而肠衣及浆膜中主要成分是硫酸皮肤素。 有机溶剂沉淀法分离提纯肝素钠的研究。肝素钠粗品中含有多种类似物杂质，如硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）及硫酸皮肤素（Dermatan Sulfate，DS），根据其在不同极性的溶剂中溶解度不同而进行分离，结果表明：乙醇、甲醇、丙酮三者均可分离提纯HP，溶剂用量分别为：9.1%—28.6%，33.3%—41.2%，16.7%—33.3%。 此外，为了从一张核磁共振氢谱上得到更多有效信息，本文用核磁共振氢谱标准加入法对肝素钠中有机残留（乙醇、甲醇、丙酮）进行了研究，并初步建立了定量计算肝素钠中有机残留（乙醇、甲醇、丙酮）新方法，结果表明：丙酮的线性回归方程为y=0.0012x-0.4631，R~2=0.9825；乙醇的线性回归方程为y=0.0003x-0.0033，R~2=0.9989；甲醇的线性回归方程为y=0.0006x+0.0293，R~2=0.9963；本方法采用NMR组学理论，对复杂混合样品的快速分析提供了思路。
【关键词】：核磁共振 肝素钠 多硫酸软骨素 定量分析 分离纯化
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R927
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 引言12-35
• 1.1 肝素钠的综述12-25
• 1.1.1 肝素钠的来源12-15
• 1.1.2 肝素钠的结构特点与分类15-22
• 1.1.3 肝素钠的生物学功能22-24
• 1.1.4 肝素钠事件后需要解决的问题24-25
• 1.2 硫酸软骨素的概述的综述25-29
• 1.2.1 硫酸软骨素的来源与分类25-26
• 1.2.2 硫酸软骨素的结构特点与生物学功能26-27
• 1.2.3 硫酸皮肤素的结构特点与生物学功能27-28
• 1.2.4 多硫酸软骨素的结构特点与生物学功能28-29
• 1.3 核磁共振在多糖分析领域的应用29
• 1.4 肝素钠事件29-30
• 1.5 肝素钠中污染物 OSCS 的测定技术进展30-35
• 第二章 肝素钠类物质 NMR 谱图分析与归属35-49
• 2.1 未分级肝素钠类物质标准品的 NMR 谱图分析与归属35-45
• 2.1.1 肝素钠标准品的1H-NMR 谱图归属35-37
• 2.1.2 肝素钠标准品的13C-NMR 谱图归属37-39
• 2.1.3 硫酸软骨素的结构特点及1H-NMR 谱图归属39-41
• 2.1.4 硫酸皮肤素的结构特点及1H-NMR 谱图归属41-42
• 2.1.5 多硫酸软骨素的结构特点及1H-NMR 谱图归属42-43
• 2.1.6 HP、CS、DS、OSCS 的特征峰归属及肝素工业品的谱图解析43-45
• 2.2 肝素钠工业品的1H-NMR 谱图归属45-49
• 2.2.1 肝素钠工业粗品的1H-NMR 谱图归属45-47
• 2.2.2 肝素钠工业精品的1H-NMR 谱图及归属47-49
• 第三章 1H-NMR 检测分析肝素钠实验条件的选择49-57
• 3.1 样品的浓度（样品量）的选择49
• 3.2 定标物及含量的选择49-52
• 3.3 转速的选择52-53
• 3.4 处理参数的选择53-55
• 3.5 仪器条件的选择55-57
• 第四章 猪小肠粘膜/肠衣/浆膜中的粘多糖组成探源57-64
• 4.1 试验材料与仪器设备57-58
• 4.1.1 原料与试剂57-58
• 4.1.2 仪器设备58
• 4.2 试验方法58-59
• 4.2.1 肝素钠粗品的提取58-59
• 4.2.2 核磁共振采样参数59
• 4.3 结果与分析59-63
• 4.3.1 肠粘膜部分实验产物鉴定59-60
• 4.3.2 肠衣部分实验产物鉴定60
• 4.3.3 肠皮部分实验产物鉴定60-61
• 4.3.4 肠粘膜、肠衣、浆膜实验结果探讨与比较61-63
• 4.4 小结63-64
• 第五章 肝素钠中 CS、DS 的分离纯化64-71
• 5.1 试验材料与仪器设备64
• 5.1.1 原料与试剂64
• 5.1.2 仪器设备64
• 5.2 试验方法64-65
• 5.2.1 肝素钠工业粗品的乙醇的分布沉淀64
• 5.2.2 肝素钠工业粗品的甲醇的分布沉淀64-65
• 5.2.3 肝素钠工业粗品的丙酮的分布沉淀65
• 5.3 结果与分析65-71
• 5.3.1 乙醇分步沉淀的实验结果65-67
• 5.3.2 甲醇分步沉淀的实验结果67-68
• 5.3.3 丙酮分步沉淀的实验结果68-69
• 5.3.4 三种有机溶剂分步沉淀的实验结果比较69-71
• 第六章 污染肝素钠中 OSCS 的分离纯化71-76
• 6.1 试验材料与仪器设备71-72
• 6.1.1 原料与试剂71
• 6.1.2 仪器设备71-72
• 6.2 试验方法72-73
• 6.2.1 新树脂的处理方法72
• 6.2.2 强碱型阴离子交换树脂吸附 OSCS 的实验方法72
• 6.2.3 实验产物的核磁共振氢谱检测72-73
• 6.3 结果与分析73-76
• 6.3.1 不同树脂型号对肝素钠分离度的影响73
• 6.3.2 树脂用量对肝素钠分离度的影响73-74
• 6.3.3 吸附 PH 对肝素钠分离度的影响74-75
• 6.3.4 吸附时间对肝素钠分离度的影响75
• 6.3.5 吸附温度对肝素钠分离度的影响75-76
• 6.3.6 盐浓度对肝素钠分离度的影响76
• 6.4 小结76
• 第七章 定量计算76-91
• 7.1 试验材料与仪器设备77
• 7.1.1 原料与试剂77
• 7.1.2 仪器设备77
• 7.2 试验方法77-78
• 7.2.1 TSP 内标液的制备77
• 7.2.2 肝素钠标准溶液的制备77
• 7.2.3 含 OSCS 的肝素钠梯度溶液的制备77-78
• 7.2.4 核磁共振采样参数78
• 7.3 结果与分析78-91
• 7.3.1 丙酮的定量实验78-79
• 7.3.2 乙醇的定量实验79-80
• 7.3.3 甲醇的定量实验80-81
• 7.3.4 肝素钠工业粗品谱图定量全分析81-84
• 7.3.5 肝素钠工业精品谱图定量全分析84-86
• 7.3.6 峰高法定量计算 HP 中的 OSCS86-88
• 7.3.7 峰面积定量计算 HP 中的 OSCS88-89
• 7.3.8 峰面积与峰高定量计算的准确度比较89-91
• 参考文献91-97
• 论文总结与创新97-98
• 致谢98-99
• 攻读学位期间发表的学术论文99-100

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本文编号：365700