类泛素蛋白NEDD8赖氨酸功能研究和修饰底物鉴定

发布时间：2017-05-29 03:09

  本文关键词：类泛素蛋白NEDD8赖氨酸功能研究和修饰底物鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的:泛素样蛋白NEDD8(Neural-precursor-cell-Expressed Developmentally Down-regulated 8)是最重要的类泛素化蛋白之一,其与底物蛋白的结合过程称为neddylation。Neddylation修饰与肿瘤细胞的增殖、转录因子的调控等高度相关。泛素的7个赖氨酸可以形成不同的泛素链结构,在各种生化过程中发挥着重要的作用。然而NEDD8上不同赖氨酸的功能至今尚未被研究。本课题中,我们将NEDD8中的各个赖氨酸分别突变成精氨酸,从而获得9个NEDD8突变体,研究了NEDD8上赖氨酸的潜在功能。作为E3泛素连接酶的一个组成蛋白,cullins是最早被发现可被NEDD8修饰的底物蛋白,cullins的neddylation修饰可以激活cullin-RING E3(CRL E3)泛素连接酶的活性。相比泛素修饰的底物蛋白研究,NEDD8修饰底物蛋白的研究少之又少。本课题中,我们通过亲和层析方法来分离富集NEDD8修饰的底物蛋白,并用质谱进行鉴定。方法:构建将各个赖氨酸分别突变成精氨酸的9个NEDD8突变体,在HEK293T细胞中过表达NEDD8野生型和突变体,免疫印迹在全蛋白液中检测各个突变体对neddylation修饰的影响,找到关键赖氨酸;共转染NEDD8野生型、突变体与NEDD8激活酶NAE1/Uba3、结合酶UBE2M,免疫印迹检测关键赖氨酸的突变对NEDD8的激活、结合过程的影响;共转染NEDD8野生型、突变体与cullins家族蛋白,纯化cullins后免疫印迹检测关键赖氨酸的突变对底物蛋白neddylation修饰及泛素修饰的影响;共转染NEDD8野生型、突变体与cullins家族成员与CRL E3泛素连接酶底物,纯化CRL E3泛素连接酶底物后免疫印迹检测关键赖氨酸的突变对底物蛋白泛素化的影响;大量过表达带His6亲和标签的NEDD8,通过标签亲和纯化NEDD8修饰蛋白,胰蛋白酶酶解后获得多肽片段,用质谱分析获得其底物蛋白。结果:(1)K27R NEDD8突变体抑制了蛋白质neddylation修饰。(2)K27R NEDD8未影响NEDD8的激活过程。(3)K27R NEDD8突变体通过与NEDD8结合酶UBE2M形成稳定的共价键,影响了NEDD8的结合过程。(4)K27R NEDD8突变体影响了cullins的neddylation修饰。(5)K27R NEDD8突变体也影响了cullins的泛素化修饰。(6)K27R NEDD8突变体大大降低了cullin RING E3泛素连接酶底物I?B?的泛素化修饰。(7)质谱分析共鉴定了84种NEDD8修饰蛋白,其中67种是新鉴定到的潜在NEDD8修饰底物蛋白,如染色体浓缩调节蛋白RCC等蛋白。结论:我们在NEDD8中发现了一个影响底物蛋白neddylation修饰的赖氨酸。NEDD8第27位赖氨酸的突变可以抑制neddylation修饰。其作用机制为K27R NEDD8突变体与结合酶UBE2M形成了某种稳定的共价键,从而无法与UBE2M形成硫酯键,进而阻断neddylation的下游进程。K27R NEDD8突变体可以抑制cullins的neddylation修饰与泛素化修饰,从而影响了cullins相关的E3泛素连接酶的活性及其底物蛋白质的泛素化。K27R NEDD8突变体在研究蛋白质neddylation修饰的生化功能中可以作为重要的显性负性突变体;NEDD8潜在底物的鉴定预示NEDD8或许参与细胞周期等某些重要生理反应的调控。
【关键词】：NEDD8 neddylation cullins cullin-RING E3泛素连接酶 泛素化
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 NEDD8 突变体通过阻断neddylation酶促反应抑制CRL E3 泛素连接酶的活性13-42
• 2.1 实验材料13-16
• 2.1.1 细胞系13
• 2.1.2 主要试剂13-14
• 2.1.3 主要仪器14-15
• 2.1.4 主要抗体15-16
• 2.2 实验方法16-27
• 2.2.1 主要试剂的配制16-19
• 2.2.2 细胞培养19-20
• 2.2.3 RNA提取20
• 2.2.4 第一链cDNA合成20-21
• 2.2.5 3XHA-NEDD8 质粒的构建21-23
• 2.2.6 3XHA-NEDD8 突变体的构建23-24
• 2.2.7 E1、E2、E3 和底物质粒的构建24-26
• 2.2.8 PEI质粒转染26
• 2.2.9 蛋白免疫印迹26
• 2.2.10 免疫共沉淀26-27
• 2.2.11 Strep-Tactin树脂纯化蛋白27
• 2.3 实验结果27-41
• 2.3.1 NEDD8 结构序列分析27-29
• 2.3.2 K27R NEDD8 突变体抑制蛋白质neddylation修饰29-30
• 2.3.3 K27R NEDD8 突变体未影响NEDD8 的激活过程30-32
• 2.3.4 K27R NEDD8 突变体影响了NEDD8 的结合过程32-34
• 2.3.5 验证UBE2M与K27R NEDD8 突变体的结合34-35
• 2.3.6 验证Cul1、Cul4A与NEDD8 的表达35-36
• 2.3.7 验证Cul1 和Cul4A蛋白纯化效果36
• 2.3.8 K27R NEDD8 突变体抑制cullins的neddylation36-37
• 2.3.9 K27R NEDD8 突变体抑制cullins的泛素化修饰37-38
• 2.3.10 K27R NEDD8 突变体影响了Cullin RING E3 泛素连接酶底物IkBa 的泛素化修饰38-39
• 2.3.11 K27R NEDD8 突变体抑制NEDD8 酶促级联反应的可能机制39-41
• 2.4 讨论41-42
• 第三章 类泛素蛋白NEDD8 修饰底物鉴定42-56
• 3.1 实验材料42-43
• 3.1.1 细胞系42
• 3.1.2 主要试剂42
• 3.1.3 主要仪器42-43
• 3.1.4 主要抗体43
• 3.2 实验方法43-47
• 3.2.1 主要试剂的配制43-45
• 3.2.2 目的基因His6-NEDD8 质粒的构建45
• 3.2.3 磷酸钙转染45
• 3.2.4 变性条件下用TALON树脂纯化His6标签蛋白45
• 3.2.5 银染45-46
• 3.2.6 溶液内酶解46
• 3.2.7 C18 除盐纯化46
• 3.2.8 LC-MS/MS检测46-47
• 3.2.9 数据分析47
• 3.3 实验结果47-53
• 3.3.1 验证目标蛋白纯化效率47-48
• 3.3.2 验证酶解效率48
• 3.3.3 质谱鉴定NEDD8 修饰蛋白的分布48-49
• 3.3.4 NEDD8 修饰底物蛋白的鉴定49-51
• 3.3.5 NEDD8 修饰蛋白的生物信息学分析51-53
• 3.4 讨论53-56
• 参考文献56-60
• 综述 类泛素化修饰neddylation的功能研究进展60-69
• 参考文献65-69
• 攻读硕士学位期间发表论文69-70
• 中英语缩略词对照表70-71
• 致谢71-72

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本文编号：404022