梓醇抑制哮喘小鼠气道黏蛋白MUC5AC高分泌的作用机制

发布时间：2020-03-17 23:23

【摘要】：目的:本研究以卵清蛋白(OVA)为过敏原复制哮喘模型,观察梓醇对哮喘小鼠的影响以及对气道黏液高分泌的抑制作用,并探讨其作用的分子机制。方法:1.分组及模型建立48只SPF级Balb/C小鼠预养一周,随机分成6组(每组8只):正常对照组(Control)、模型组(Model)、地塞米松组(DEX)、梓醇低剂量组(CL)、梓醇中剂量组(CM)、梓醇高剂量组(CH)。除正常组外其他各组于第1、8、15d腹腔注射OVA和Al(OH)3的混悬致敏液(OVA 0.2mg/m L,Al(OH)3 5 mg/mL)致敏,于第21-27d雾化OVA(2%)生理盐水激发液复制哮喘模型。正常对照组以生理盐水代替致敏液和激发液。2.给药方案于实验第21-27d雾化激发前1h灌胃。剂量为:DEX组1mg/kg、CL组20mg/kg、CM组40 mg/kg、CH组80 mg/kg,正常对照组和模型对照组以生理盐水灌胃。3.观察指标实验第25-27d,雾化激发时观察最初15min内小鼠的引喘潜伏期。第28d,无创小鼠肺功能仪测定气道反应性(Penh)。第28d Penh实验完成后处死小鼠,收集血清、左肺肺泡灌洗液(BALF)和右肺中叶。酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清中OVA-IgE和肺泡灌洗液(BALF)中IL-13、eotaxin、IL-8、MUC5AC、TSLP、IL-33、MCP-1、IL-1β、AREG(amphiregulin,双调蛋白)、IL-9和IL-6的含量。HE和PAS染色观察肺组织病理改变和杯状细胞增生变化。免疫组化观察肺组织支气管MUC5AC、FOXA2、EGFR、NFAT3和P-NFAT3表达情况。流式细胞术分析梓醇对于肺组织中ILC2s的影响。结果:1.引喘潜伏期雾化激发期间,与正常对照组相比,各实验组小鼠先出现烦躁不安、抠鼻瘙痒、抓耳挠腮、毛发凌乱现象,随后腹肌抽搐,出现持续的喘息症状。随着雾化激发时间的延长小鼠体重下降,精神不振。给予梓醇和DEX干预治疗后,与哮喘模型组相比上述症状得到明显改善,引喘潜伏期也明显延长(P0.01)。2.气道反应性各组小鼠Penh都随着乙酰甲胆碱浓度的增加而增高。与正常组相比,在乙酰甲胆碱浓度为6.25mg/m L-50mg/m L时,模型组的Penh显著增高(P0.01);与模型组相比,CH组、CM组和DEX组在乙酰甲胆碱浓度为25mg/mL和50mg/m L时能明显抑制Penh的增长(P0.01或P0.05);与模型组相比,CL组在乙酰甲胆碱浓度为50mg/m L时能明显抑制Penh的增长(P0.01)。3.病理学改变梓醇能明显改善哮喘小鼠肺组织炎性病理变化,并且抑制气道杯状细胞的增生。与模型组相比,梓醇各组杯状细胞阳性面积比例明显降低(P0.01)。4.黏蛋白MUC5AC ELISA测定结果和免疫组化结果显示,CH和CM降低BALF中MUC5AC含量,抑制支气管MUC5AC表达。5.OVA-IgE和炎性细胞因子实验发现,梓醇显著降低血清OVA-Ig E水平,对BALF中IL-1β、IL-8、IL-13、IL-25、eotaxin、MUC5AC、MCP-1、TSLP、AREG IL-9和IL-6的水平具有明显的降低作用。6.MUC5AC信号通路梓醇能提高支气管MUC5AC生成IL-13信号通路中FOXA2和NFAT3的表达水平,抑制P-NFAT3的表达;抑制EGFR信号通路中EGFR的表达。流式细胞术结果显示,与哮喘模型组相比,梓醇能够明显降低哮喘小鼠肺组织中ILC2s的比例。结论:1.通过小鼠引喘潜伏期、HE染色、PAS染色、Penh等指标,确定本实验哮喘模型建模成功,梓醇具有明显的抗哮喘作用。2.梓醇对于气道黏蛋白MUC5AC分泌具有显著地抑制作用。3.梓醇对BALF中多种致炎细胞因子具有明显的抑制作用,并且能够抑制血清中OVA-IgE的水平。4.梓醇可能通过的IL-13和EGFR两条信号通路抑制气道MUC5AC的高表达。
【图文】：

功能图,功能图

图 1 ILC2s 功能图（Current Opinion in Immunology. 2013,25 (2) :148-155）Fig1 The function of ILC2s活的 ILC2s 可产生大量的炎症细胞因子，与 Th2 炎症反应密切相关。ILC2子包括 IL-13、IL-4、IL-5、IL-6、AREG 等，这些细胞因子在嗜酸性粒细单核细胞、B 细胞等炎症的活化中起到了关键作用。另外特别引起我们注意和其活化的 Th2s 细胞均可产生大量的 IL-13，IL-13 可作用于巨噬细胞，活化能增强，在清除外来物的同时产生，还起到抗原提呈的作用；IL-13 还能作 PC 细胞并产生抗体，抗体进一步可以与肥大细胞，嗜碱性粒细胞等结合引放各种炎症介质；IL-13 可直接作用于哮喘发作过程中的黏液高分泌和气道成[25, 26]。另外，ILC2s 产生的 Amphiregulin 为 EGF 家族成员，与杯状细胞结合可启动杯状细胞黏蛋白 MUC5AC 的分泌。2）嗜酸性粒细胞（Eosinophils）来源于骨髓 CD34+祖细胞，其能够分泌多种

信号通路,磷酸化位点,活化的,磷酸化

酶 B（protein kinase B，PKB/AKT）的 N 端 PH 结构域结合，使 AK膜上，并在 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1（PDKI）的辅助下，通过酸磷酸化位点（Thr308）和丝氨酸磷酸化位点（Ser473）磷酸化而途径激活后，可进一步激活下游的活化 T 细胞核因子（3Nuclear factorFAT3）继而上调 MUC5AC 的 mNRA 表达，促使 MUC5AC 分泌增加介导的信号通路刺激作用下，机体细胞可产生中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和 EG体结合引起 TACE 酶激活，将 pro-EGFR ligand 断裂释放 EGFR lig胞膜上的 EGFR 结合后，引起 EGFR 磷酸化而活化，引起 RAS-G进而进入级联反应，顺序激活 Raf，MEK1/2，，ERK1/2，SP1,活化的 MUC5AC 的表达[23]。另外，活化的 P-EGFR 可抑制 FOXA2 的表达起黏液的高分泌。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】