基于HIF-1α梓葛冻干粉针抗脑缺血血管内皮细胞凋亡和促新血管形成作用及其机制研究

发布时间：2020-03-20 02:32

【摘要】：背景 HIF-1α是脑缺血后缺血半暗带内细胞广泛表达的转录因子,参与调控缺氧下细胞存活以及新血管形成。但该因子在脑缺血后出芽式血管新生关键步骤——tip细胞形成以及血管发生关键步骤——内皮祖细胞(EPCs)归巢的影响尚不清楚。梓葛冻干粉针为本实验室创制的中药单体复方新药,由梓醇和葛根素两种中药单体配伍组成。前期研究表明梓葛冻干粉针具有显著的抗脑缺血作用,包括减轻神经功能损伤、减小脑梗死体积、减轻脑水肿等。梓葛冻干粉针是否对缺血损伤的关键靶点脑血管具有保护作用,以及是否具有促进缺血后新血管形成作用尚不清楚。目的1.观察HIF-1α在脑缺血后血管新生过程中对促进tip细胞形成及EPCs归巢的作用;2.观察梓葛冻干粉针对脑血管缺血损伤的保护作用和促新血管新生作用;并探索其作用机制。方法与结果1.HIF-1α在脑缺血后新血管形成中的作用机制研究方法(1)采用电凝法制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。造模成功标准:缺血梗死中心区域血流量(r CBF)下降80%及以上;m NSS评分为3-8分。造模成功的MCAO大鼠分为:control sh RNA组、HIF-1αsh RNA组。(2)缺血7天,观察缺血区血管分支及微小血管(直径㩳20 mm)数量;免疫荧光染色观察脑内tip细胞数量;Western blot、免疫荧光染色检测脑内EPCs归巢、血管表达量以及星形胶质细胞数量。(3)缺血7天,免疫荧光染色观察敲降脑内HIF-1α表达对内源性EPCs在脑内归巢的影响。(4)缺血14天,评价大鼠神经功能损伤、梗死区周围血流量、脑梗死体积、梗死区周围血管密度。(5)原代骨髓源EPCs经Brd U标记后注入MCAO大鼠体内,梗死后第7天观察敲降脑内以及EPCs HIF-1α对外源性EPCs归巢的影响;第10天观察外源性EPCs融合入血管壁以及Dll4表达情况。(6)2%O2条件下,观察敲降HIF-1α对EPCs小管形成、细胞球出芽,以及EPCs出芽、归巢相关蛋白表达的影响。结果慢病毒介导sh RNA转染显著抑制大鼠缺血脑组织内HIF-1α表达及血管出芽和EPCs归巢。(1) 导致脑损伤加重。缺血14天,敲降大鼠脑内HIF-1α表达,导致脑梗死体积、m NSS评分显著增加,r CBF(脑血流)显著降低。(2)导致脑缺血区新血管形成障碍。缺血14天,敲降大鼠脑内HIF-1α表达,导致缺血周围血管网状结构结构形成障碍、微血管密度降低。(3)导致血管出芽新生减少。脑缺血7天,敲降大鼠脑内HIF-1α表达,导致缺血区皮层血管分支数量、微小血管(直径㩳20 mm)数量显著减少;脑内tip细胞(血管顶细胞)显著减少。(4)导致EPCs介导的血管新生障碍。脑缺血7天,敲降脑内HIF-1α表达,导致脑内内源性EPCs归巢数量减少;抑制脑内或外源性EPCs HIF-1α表达,均导致外源性EPCs归巢、融合入原位血管、以及Dll4表达水平显著降低。2%O2条件下,敲降HIF-1α表达,导致EPCs小管形成、细胞球出芽数量显著减少;导致EPCs出芽相关蛋白VEGF、Dll4、NRP1、Flk1表达降低。(5)导致EPCs归巢以及出芽式血管新生微环境受损。脑缺血7天,敲降脑内HIF-1α表达,导致脑内CXCL12/CXCR4、HMGB1、VEGF-A、p ERK、Flk1表达量及反应性星形胶质细胞数量显著降低。在2%O2条件下,敲降HIF-1α表达,导致EPCs上CXCR4、星形胶质细胞上CXCL12和HMGB1表达降低。(均p㩳0.05)2.梓葛冻干粉针基于HIF-1α对BMECs缺血损伤的抗凋亡作用及机制研究 2.1原代脑微血管内皮细胞培养、鉴定方法(1)采用扫描电镜、透射电镜观察脑微血管内皮细胞(BMECs)形态和细胞紧密连接结构;采用免疫标记物对细胞进行免疫表型鉴定,并对可能的杂细胞种类及污染程度进行鉴定;血管内皮细胞功能鉴定包括:TEER检测、小管形成。(2)采用OGD+LON构建体外缺血半暗带模型:OGD(氧糖剥夺损伤)损伤BMECs 20小时,再将细胞置于LON(低氧、低营养培养条件:20%血清培养基稀释4倍、2%O2)下继续培养。MTT检测细胞活性,评价模型对细胞的损伤情况。结果(1)原代脑血管内皮细胞(BMECs)纯度达99%以上。扫描电镜、透射电镜、内皮细胞功能以及多个血管内皮细胞标记物染色结果表明,培养的细胞具有血管内皮细胞特征;且细胞纯度高,大于99%。(2)OGD+LON具有缺血半暗带损伤特征。那微血管内皮细胞(BMECs)经OGD损伤20小时存活率约70%;继续LON培养12小时,细胞存活率约70%左右;16小时下降至62%;28小时降至29%。表明经OGD损伤的BMECs在LON培养下可以在有限的时间里存活,与缺血半暗带内细胞存活情况相似。(均p㩳0.05)2.2自主构建脑缺血半暗带血管损伤体外模型方法(1)采用电凝法制备MCAO大鼠,并将造模成果的大鼠随机分组:MCAO组、梓葛冻干粉针各剂量组(65.4 mg/kg、32.7 mg/kg、16.4 mg/kg)。采用随机数字表分组后对各组大鼠脑血流(r CBF)和m NSS评分进行统计分析,确认各组有无显著差。(2)给药4天,观察缺血侧大脑血管形态、血管内皮细胞凋亡。给药7天,检测大鼠脑内HIF-1α蛋白量。(3)给药14天,检测大鼠神经功能损伤(m NSS评分)、脑梗死体积以及脑血流(r CBF)。(4)体外研究:采用OGD、OGD+LON模型,观察梓葛冻干粉针(24.5μg/m L、49μg/m L和98μg/m L)对BMECs细胞活性、凋亡的影响;采用OGD+LON模型,观察梓葛冻干粉针对BMECs HIF-1α表达及入核的影响;以及敲降HIF-1α对药物促细胞存活作用、抗凋亡的影响;采用阻断剂抑制ERK或m TOR,观察梓葛冻干粉针对HIF-1α表达、BMECs存活的影响。结果(1)梓葛冻干粉针对脑缺血大鼠具有抗脑缺血损伤作用。给药14天,梓葛冻干粉针65.4 mg/kg显著降低脑梗死体积;梓葛冻干粉针(65.4 mg/kg、32.7 mg/kg)显著增加梗死灶周围血流量。(2) 梓葛冻干粉针对血管内皮细胞具有显著抗凋亡作用。动物实验:给药4天,梓葛冻干粉针(65.4 mg/kg,32.7 mg/kg)显著改善MCAO大鼠血管损伤形态、减少凋亡BMECs数量。细胞实验:与OGD+LON组比较,梓葛冻干粉针49μg/m L、98μg/m L组细胞活性显著升高;梓葛冻干粉针49μg/m L显著抑制线粒体Cyt-c释放,减少Bax、Bad、cleaved-Caspase3,增加Bcl-2表达量。(3)梓葛冻干粉针抗凋亡作用依赖于HIF-1α。给药7天,梓葛冻干粉针65.4mg/kg、32.7 mg/kg显著增加MCAO大鼠脑内HIF-1α表达。细胞实验表明,梓葛冻干粉针(49μg/m L)能促进BMECs HIF-1α表达和入核;敲降HIF-1α表达,导致梓葛冻干粉针促细胞存活、抗细胞凋亡作用显著减弱。(4)梓葛冻干粉针抗凋亡作用及上调HIF-1α表达依赖于ERK和PI3K/AKT/m TOR。细胞实验表明,抑制m TOR通路或者ERK通路均导致梓葛冻干粉针(49μg/m L)上调HIF-1α表达、促细胞存活、抗细胞凋亡作用减弱。(均p㩳0.05)3.梓葛冻干粉针基于HIF-1α对脑缺血大鼠脑血管内皮细胞保护作用及机制研究方法(1)MCAO大鼠模型制备及筛选同第一章,动物分组同第三章。(2)术后,采用Brd U(50 mg/kg)标记新生细胞。给药7天,采用免疫荧光观察各组tip细胞(v WF/Dll4)、EPCs(CD34/Flk1)、CD31/Brd U数量,以及VEGF、HMGB1表达量;给药14天,免疫荧光标记CD31计数微血管密度;WB检测脑组织中VEGF和Ang2表达量。(3)在低氧、低营养培养条件下观察梓葛冻干粉针(49μg/m L)对BMECs小管形成、细胞增殖以及细胞迁移的影响。sh RNA敲降HIF-1α后,观察药物作用是否受到影响。结果(1)梓葛冻干粉针促进脑缺血后新血管形成。给药14天,与MCAO组相比,梓葛冻干粉针65.4 mg/kg组、32.7 mg/kg组微血管密度显著增加。(2)梓葛冻干粉针促进脑缺血后tip细胞形成和内皮祖细胞归巢。给药7天,与MCAO组相比,梓葛冻干粉针65.4 mg/kg组v WF/Dll4、CD34/Flk1、VEGF+细胞显增多,HMGB1表达显著增多。(3)梓葛冻干粉针促进体外血管新生作用依赖于HIF-1α。与LON(低氧、低营养)组相比,梓葛冻干粉针49μg/m L组脑微血管内皮细胞(BMECs)小管形成、Brd U+细胞、细胞迁移显著增加;与梓葛冻干粉针+control sh RNA组相比,梓葛冻干粉针+HIF-1αsh RNA组脑微血管内皮细胞(BMECs)小管形成、细胞迁移显著减弱,Brd U阳性细胞数量无显著差异。(均p㩳0.05)结论1.本实验结果显示,HIF-1α是维持脑缺血后损伤神经功能自我修复、新血管再生的关键因子。HIF-1α通过调控新血管生成微环境促进tip细胞的形成和EPCs的归巢,从而促进出芽式血管新生和血管发生。2.自创的体外缺血半暗带模型(OGD+LON)具有一定的缺血半暗带BMECs损伤特征,能作为缺血半暗带体外研究载体。3.梓葛冻干粉针对缺血损伤的脑微血管内皮细胞具有显著抗凋亡作用。作用机制为通过激活ERK和PI3K/AKT/m TOR上调HIF-1α表达,从而发挥抗细胞凋亡作用。4.梓葛冻干粉针能促进大鼠脑缺血后新血管形成,其作用可能与上调HIF-1α表达、促进tip细胞形成和EPCs归巢相关。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】