基于CHS基因多态性的甘草黄酮类化合物生物合成分子机制研究

发布时间：2020-03-24 00:06

【摘要】：甘草作为我国最常用的大宗药材之一,具备补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药等多种功效。《中国药典》自2010版明确规定:按干燥品计算,甘草样品中甘草苷(C_(21)H_(22)O_9)的含量不得少于0.50%。目前,栽培甘草广泛存在品质退化及甘草苷含量低等问题,难以达到药典规定的最低标准。查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)作为甘草苷生物合成途径中的第一个关键酶和限速酶,对于调控甘草中黄酮类化合物的生物合成具有重要作用。研究功能基因CHS的多态性及其对黄酮类化合物积累的作用机制,对于提高栽培甘草质量,指导甘草分子育种具有重要的理论价值和实践意义。本论文对60株同一栽培条件下的两年生甘草进行了 4种主要黄酮类化合物的含量测定;从含量最高的乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)及含量最低的胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)中筛选样品,利用RT-PCR法克隆CHS基因,并对其进行多态性分析;研究甘草CHS基因编码区SNP位点与甘草中黄酮类化合物含量间的相关性,筛选出甘草黄酮高/低含量对应的特异CHS基因型;构建重组酵母表达载体pPIC9K-CHS,采用电转化法将特异CHS基因导入毕赤酵母GS115菌株中,经甲醇诱导表达后,利用SDS-PAGE进行检测。本论文共取得了如下研究结果:(1)三基原甘草样品中4种主要黄酮类化合物的含量测定结果:利用HPLC法对同一栽培条件下的两年生乌拉尔甘草、光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)、胀果甘草各20株进行甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素的含量测定,发现:4种黄酮类化合物的含量均具有显著相关关系,在三基原甘草样品间均存在显著性差异,且乌拉尔甘草中含量均为最高,光果甘草次之,胀果甘草最低。将含量最高的5株乌拉尔甘草作为黄酮高含量组,将含量最低的5株胀果甘草作为黄酮低含量组,进行后续CHS基因的克隆及序列分析。(2)甘草CHS基因的克隆及序列分析结果:从黄酮高/低含量组样品中共计克隆得到336条CHS基因cDNA序列,全长均为1175 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码1条由389个氨基酸残基组成的多肽。经DNAMAN比对分析,这336条cDNA序列可确定为137种单倍型(单倍型1～137),一致性为98.98%,存在249个变异位点;编码102种氨基酸序列类型(AA-1～AA-102),一致性为99.40%,存在130个变异位点。在GenBank数据库中完成全部序列的注册。(3)甘草CHS基因多态性分析结果:对137种甘草CHS基因单倍型及其编码的102种氨基酸序列类型进行分析,统计结果显示:甘草的主流CHS基因型为单倍型10及92,其对应氨基酸序列类型为AA-3及AA-60;黄酮高含量组甘草样品特异主流CHS基因型为单倍型60,其对应氨基酸序列类型为AA-35;黄酮低含量组甘草样品特异主流CHS基因型为单倍型63,其对应氨基酸序列类型为AA-36。(4)甘草黄酮高/低含量组特异CHS氨基酸序列(AA-35与AA-36)的生物信息学分析结果:理化性质:甘草CHS蛋白分子量大小约为43 KDa,氨基酸序列AA-35和AA-36的等电点、不稳定系数及亲水系数差别较小,且半衰期一致。二级结构:AA-35和AA-36的二级结构仅在193位点处存在无规卷曲/延长链、225位点处存在无规卷曲/延长链、237位点处存在α-螺旋/延长链的差异,与一级结构差异较一致。且活性位点均为164位点,活性区域均为156位点至172位点之间。三级结构:AA-35和AA-36的同源模建结构均具有良好的立体化学参数和空间结构,可用于后续分析。模建蛋白结合位点分析结果显示,仅AA-35的229位缬氨酸位于结合位点区域,能够与丙二酰辅酶A结合,而AA-35的193位异亮氨酸、AA-36的193位缬氨酸与229位苏氨酸均与底物结合无关。可从分子水平上推测解释黄酮高/低含量组甘草样品中特异性CHS氨基酸序列AA-35与AA-36在193、229位点处的差异与黄酮不同水平的积累相关。聚类分析:通过构建系统进化树,发现CHS氨基酸序列在不同类别生物样本间具有良好的区分度,与其进化关系一致。甘草主流CHS氨基酸序列AA-3与AA-60先聚为一支,再与黄酮低含量组特有氨基酸序列AA-36聚为一支,最后与黄酮高含量组特有氨基酸序列AA-35聚为一支。以上聚类结果可以从进化关系层面上解释黄酮高/低含量组特有氨基酸序列AA-35/AA-36的差异明显。(5)转甘草特异性CHS基因毕赤酵母工程菌构建及表达分析:以pPIC9K为载体,构建了携带甘草特异CHS基因型的毕赤酵母GS115工程菌GS115-P-CHS10、GS115-P-CHS92、GS115-P-CHS60 和 GS115-P-CHS63,经 His~+转化子、遗传霉素 G418及Mut+型重组子筛选后,利用PCR及测序法进行验证,经甲醇对验证正确的工程菌进行诱导表达后,利用SDS-PAGE进行检测,得到与甘草CHS蛋白大小一致(43 kDa)的产物,即诱导表达成功。
【图文】：

生物合成途径,黄酮类化合物,生物合成,分子育种

基于ＯＫ基因多态性的甘草黄酮类化合物生物合成分子机制研究合成具有重要作用。其催化第一步反应，将３分子的丙二酰辅酶Ａ（ｍａｌ0ｎｙｌ－子的４－香豆酰辅酶Ａ邋（４－ｃｏｕｍａｒｏｙｌ－ＣｏＡ）结合，形成第１个具有Ｃ１３骨合物一柚皮素查尔酮（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ邋ｃｈａｌｃｏｎｅ邋），该产物进一步衍化生成了各［１９］。因此，深入分子水平研究与黄酮类化合物生物合成直接相关的功能基性及其对黄酮类化合物积累的作用机制，对于优质甘草药材的分子育种具价值和实践意义。逡逑

甘草,对照品,甘草黄酮,基因多态性

逦基于Ｃ７Ｃ基因多态性的甘草黄酮类化合物生物合成分子机制研究逦逡逑ＶＷＤ１邋Ａ，邋ｉ＾｛ｘ＝２７６邋ｎｍ，，邋ＩＴ邋（２０ｉａｉ０２１＼Ｒ６邋ｔ0２１邋Ｄ）逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284

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