石菖蒲木质素类化合对破骨细胞形成的抑制作用及其机制研究

发布时间：2020-03-24 01:20

【摘要】：传统中医学中,石菖蒲作为许多中药的活性组分,被用于治疗多种疾病。据文献报道,石菖蒲具有神经保护、抗炎症、抗氧化等多种生物活性。石菖蒲已被用于类风湿性关节炎的治疗。类风湿性关节炎是一种慢性炎症性骨疾病,破骨细胞在类风湿性关节炎的病理进程中发挥重要作用。破骨细胞是一种多核的巨大细胞,是体内唯一行使骨吸收功能的细胞。目前越来越多的研究将破骨细胞作为治疗骨疾病的靶点,而石菖蒲在这类骨疾病上的研究目前还较少。我们的前期研究发现了一个由石菖蒲根茎中提取的以α-asarone为母核的木质素类化合物Tatarinan O(TO),对破骨细胞生成有抑制作用。此外还有其它几个石菖蒲根茎中提取的木质素类化合物,均与TO同为α-asarone的多聚体。但是这些以α-asarone为母核的化合物是否可以同样调节破骨细胞的分化及骨吸收功能仍然没有报道。因此,我们将研究这些化合物对破骨细胞分化及骨吸收功能的作用及其机制。通过TRAP染色实验,我们检测了这些化合物对破骨细胞分化的作用。我们发现仅有Tatarinan N(TN)与Tatarinan T(TT)这两个化合物能够对RANKL诱导的破骨细胞分化有抑制作用,其它的几个化合物均不影响破骨细胞分化。在之后的研究中,我们进一步检测了TN与TT对RANKL引起的破骨细胞分化和LPS诱导的小鼠骨丢失的抑制作用,并对其作用机制进行了研究。在细胞形态学上,我们分别进行了TRAP染色、骨吸收和F-actin环染色实验。结果表明TN和TT在RANKL引起的破骨细胞分化早期阶段以浓度依赖的方式抑制破骨细胞生成,F-actin环形成及其骨吸收功能。为阐明TN和TT调节RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收功能的分子机制,我们通过荧光定量PCR方法检测了一些破骨细胞相关基因表达的变化。这些基因包括OSCAR,DC-STAMP,αvβ3,Apt6v0d2,TRAP,Cts K和MMP-9。研究表明TN和TT均显著抑制这些RANKL诱导的标志性基因的表达。这些数据显示TN和TT能够通过调节标志性基因的表达来阻碍破骨细胞分化,F-actin环形成和骨吸收功能。NFATc1是调节破骨细胞分化的核心转录因子,调节着破骨细胞相关基因的表达。实验表明,TN和TT均能够在mRNA水平和蛋白水平上显著抑制NFATc1的表达。这说明TN和TT可能通过调节NFATc1来抑制标志性基因的表达及破骨细胞分化。此外,TN和TT还可以抑制NFATc1的上游转录因子c-Fos在mRNA水平和蛋白水平上的表达。为了进一步阐明TN和TT调控破骨细胞分化的作用机制,我们继续通过western blot实验,免疫荧光实验和fluo-4 AM钙离子探针观察了TN和TT调节NFATc1活化的信号转导机制。结果表明TN显著抑制RANKL引起的NF-κB,ERK,p38通路和Syk-Btk-PLCγ2级联反应的活化。此外,TN能够抑制胞内钙离子水平的升高和钙依赖磷酸酶催化亚基PP2B-Aα的表达。与TN不同,TT不影响上述信号通路的活化。最后,我们通过动物实验进一步研究了TN和TT对LPS引起的小鼠骨丢失的潜在作用。Micro-CT结果表明,TN和TT均改善LPS引起的骨显微结构指标的变化,包括骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁离散度(Tb.Sp)、骨密度(BMD)、骨体积/总体积(BV/TV)。HE染色和TRAP染色结果表明,TN和TT能够有效缓解LPS诱导的小鼠骨组织结构破坏和破骨细胞过度活化。这些结果表明,TN和TT均对LPS诱导的小鼠骨丢失具有保护作用。总结:体外细胞学研究表明,TN与TT均能够抑制关键转录因子NFATc1和c-Fos,并下调破骨细胞标志性基因的表达,阻碍骨架蛋白F-actin环形成,从而抑制RANKL诱导破骨细胞分化,减少骨吸收面积。研究表明,TN可能通过抑制NF-κB,MAPKs和PLCγ2-Ca~(2+)-calcineurin信号通路活化来调节NFATc1的活化;而TT不影响上述信号通路的活化。体内研究表明,TN及TT给药均可以显著改善LPS引起的小鼠骨结构破坏及破骨细胞过度活化。我们的研究表明TN和TT均可以作为破骨细胞相关的骨丢失性相关疾病的潜在治疗药物。
【图文】：

rone 表现出抗氧化活性 的水平，抑制血管紧张高血压模型比较石菖蒲取物可降低模型大鼠心发现，，石菖蒲中提取的生成，减少骨吸收面积质疏松潜在药物[16]。

(C)中提取的木质素类化合物对 RANKL 诱导的破骨细提取的木质素类活性单体化学结构式；（B）木质素（C）木质素类化合物影响破骨细胞生成统计学结果he effects of lignin-like compounds extracted from AcoSchott on RANKL-induced osteoclast formationcture of lignin-like compounds that extracted from AcoRAP staining assay result; (C) statistic result of lignin-leffecting osteoclast formation. **p≤0.01示了在破骨细胞培养初期加入不同浓度的 TN 进行干 μM TN 进行干预的结果。如图 2.2A 和 B 所示，在培进行干预时，TN 能够以浓度依赖的形式抑制 RAN 浓度在 0.625 μM 及以下时，对破骨细胞几乎没有作
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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本文编号：2597571