三七皂苷R1对Ang Ⅱ诱导动脉粥样硬化的影响及机制研究

发布时间：2020-03-24 07:26

【摘要】：目的本研究拟从体内及体外实验相互印证,探讨三七皂苷R1(Notoginsenoside R1,NR1)对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的防治作用。并以丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)/核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路为切入点,探讨NR1在细胞分子和基因水平上防治动脉粥样硬化的作用机制,为AS的靶点治疗提供新的实验依据。方法1、理论部分:回顾了AngⅡ与AS的研究进展,深入分析AngⅡ介导的MAPK/NF-κB信号通路与AS的相关性,并结合中医理论与NR1对心血管系统药理作用研究概况,为探讨NR1以MAPK/NF-κB信号通路作为治疗靶点干预AS提供理论依据。2、体内实验:采用AngⅡ诱导Apo E-/-小鼠AS模型的复制方法,即将含有AngⅡ1000ng/kg/min的ALZET渗透泵植入小鼠皮下诱导4周,联合正常饮食。将Apo E-/-雄性小鼠40只,随机分成2组,其中AngⅡ组(对照组),NR1干预AngⅡ组(给药组)每组各20只。于造模第2天,给药组予以NR1 25mg/kg每日腹腔注射,对照组每日腹腔注射与NR1等体积的生理盐水。(1)于术前1周、术后1、2、4周测量小鼠体重,根据体重变化调整NR1腹腔注射剂量。(2)应用Kent无创血压监测系统监测小鼠血压变化。(3)采用生化法检测小鼠血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)水平。(4)采用苏木精伊红染色法(hematoxylin eosin staining,HE)检测小鼠主动脉根部斑块面积及主动脉根部和头臂干单位坏死中心面积。(5)采用油红O染色检测小鼠主动脉斑块内的脂质沉积。(6)采用苦味酸-天狼猩红(Picric Sirius red,PSR)染色检测斑块内胶原纤维含量。(7)采用免疫荧光法检测斑块内a-平滑肌肌动蛋白(smooth musclea-actin,a-SMA)、CD68的表达。(8)采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子-a(Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1b(interleukin-1 beta,IL-1b)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattratant protein-1,MCP-1)水平。(9)采用Real-Time PCR检测分析血管炎症相关基因(TNF-a、IL-6、IL-1b、MCP-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)及血管细胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,m RNA)的表达。(10)采用Western blot法检测血管中IκB激酶复合物(inhibitor-κB kinase,IKK)、p-IKK、P65、p-P65、κB抑制蛋白(inhibitor ofκB,IκB)、p-IκB蛋白的表达。3、体外实验:为探讨NR1对AngⅡ通路本身的影响,我们选择MOVAS细胞(小鼠主动脉平滑肌细胞)作为NR1作用的载体。采用AngⅡ诱导MOVAS细胞建立平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖模型,模拟VSMC在AS中的作用。将Movas细胞分为四组(对照组、NR1组、AngⅡ组、AngⅡ+NR1组),予以AngⅡ刺激量5μM,NR1处理浓度50μM。(1)应用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测各组细胞的增殖活性。(2)应用5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,Brd U)法检测各组细胞增殖中DNA的合成情况。(3)应用Transwell小室检测各组细胞纵向迁移能力。(4)应用划痕愈合实验检测各组细胞横向迁移能力。(5)应用Western blot法检测AngⅡ组、AngⅡ+NR1组细胞血管紧张素Ⅱ1型受体angiotensin type 1 receptor(AT1R)、血管紧张素Ⅱ2型受体angiotensin type 2 receptor(AT2R)水平及MAPKs(ERK、JNK、P38MARK)通路的激活情况。结果1、体内实验:AngⅡ皮下诱导Apo E-/-小鼠4周,成功建立AS模型。(1)体重变化比较:两组小鼠的体重在同时段比较无显著性差异(P0.05)。(2)血压比较:治疗前两组小鼠收缩压(systolic blood pressure,SBP)水平相当(P0.05),AngⅡ泵入后2周、4周SBP均明显升高,但组间比较无明显差异(P0.05)。(3)血脂指标比较:治疗前两组小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C无显著差异(P0.05)。治疗后:与同组比较,给药组血清TG、LDL-C指标有明显改善(P0.01或P0.05);与对照组比较,给药组在降低血清TG、LDL-C方面优于对照组(P0.01)。(4)HE染色:与对照组比较,给药组能显著减少小鼠主动脉根部的AS斑块面积(P0.01),明显减少主动脉根部和头臂干的单位坏死中心面积(P0.01)。(5)油红O染色:与对照组相比,给药组能显著减少小鼠主动脉斑块内的脂质积聚(P0.05)。(6)PSR染色:与对照组比较,给药组可显著抑制斑块内胶原纤维的生成。(7)免疫荧光检测:与对照组相比,给药组可明显降低小鼠主动脉壁内巨噬细胞的浸润;增加斑块内SMC的含量。(8)血清学指标:与对照组比较,给药组血清学指标TNF-a、IL-6、IL-1β和MCP-1均有改善(P0.05或P0.01)。(9)Real-Time PCR:与对照组相比,给药组能显著降低血管内TNF-a、IL-6、IL-1β、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1 m RNA的表达(P0.01或P0.05)。(10)Western blot法:与对照组相比,给药组能明显上调IκB蛋白水平(P0.01);显著抑制IKK和IκB的磷酸化(P0.01)。2、体外实验:AngⅡ诱导Movas细胞成功建立VSMC增殖模型。(1)CCK-8实验:与Control组相比,NR1组在450nm波长处不同时间段测得吸光值无明显差异(P0.05);AngⅡ组随着作用时间的延长(12-60h),其促增殖作用持续存在(P0.01)。当AngⅡ+NR1作用12h时,NR1抑增殖作用表现明显,在12、24、48、60h吸光度差异有统计学意义(P0.05或P0.01)。(2)Brd U实验:与Control组相比,NR1组在450nm波长处吸光度无明显差异(P0.05);AngⅡ组吸光度明显上升(P0.01)。与AngⅡ组相比,AngⅡ+NR1组吸光度显著下降,差异有统计学意义(P0.01)。(3)Transwell实验:与Control组相比,NR1组穿过小室膜的细胞数无明显差异(P0.05);AngⅡ组穿过小室膜细胞数明显增多(P0.01)。与AngⅡ组相比,AngⅡ组+NR1组穿越小室膜的细胞数明显减少,差异有统计学意义(P0.01)。(4)细胞划痕实验:与Control组相比,NR1组细胞损伤愈合率无明显差异(P0.05);AngⅡ组细胞愈合率明显降低(P0.01)。与AngⅡ组相比,AngⅡ组+NR1组细胞损伤修复率明显提高,差异有统计学意义(P0.01)。(5)Western blot法:与AngⅡ组相比,AngⅡ+NR1组中AT1R水平明显下调(P0.05),AT2R水平则无差异(P0.05)。与AngⅡ组相比,AngⅡ+NR1组ERK、P38、JNK的磷酸化水平明显受到明显抑制(P0.01)。结论1.通过AngⅡ诱导Apo E-/-小鼠4周成功建立动脉粥样硬化模型。2.三七皂苷R1抗AngⅡ诱导ApoE小鼠AS斑块的效果明确。3.三七皂苷R1抗AS的作用与增加斑块内平滑肌细胞含量、减少巨噬细胞聚集相关。4.三七皂苷R1具有降低动脉粥样硬化小鼠血脂的作用,能通过降低AS的危险因素而对疾病进行防治。5.三七皂苷R1抗AS斑块的效果不仅与降低循环中的炎症因子水平相关,而且还可显著抑制AngⅡ诱导Movas细胞的增殖和迁移,通过下调AT1R来抑制MAPKs(p-ERK、p-P38MARK、p-JNK)的激活,进而抑制主动脉壁组织中NF-κB信号通路的活化,下调其下游细胞因子(TNF-?、IL-6、IL-1β)、趋化因子(MCP-1)及黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)的表达,从而延缓AS的病理进程。
【图文】：

斑块形成,HE染色,根部,实验小鼠

图 1 两组小鼠主动脉根部可见斑块形成（HE 染色，×40 倍）注：**P<0.01。3.1.3 实验动物体重变化我们对两组实验小鼠分别于 0 周（泵植入周）、泵后 1、2、4 周称取体重，对各组数据进行统计分析。P 值：表示两组实验小鼠体重的比较。经测量后统计，各周小鼠的体重 P 值均大于 0.05，即两组实验小鼠在实验过程中体重均有可比性。结果见表 1。表1 两组实验小鼠各阶段的体重比较（g，x±S）组别 N 0 周 1 周 2 周 4 周对照组 17 28.50 2.25 29.81 2.48 30.21 2.37 29.50 3.55给药组20 27.07 2.5328.29 2.6429.03 2.3228.79 2.55

实验小鼠,治疗前后,对照组,给药

给药组在降低血清 TG、LDL-C 方面优于对照组(P<0.01)。表明 NR1 抗 AS 的效果与调脂作用相关。结果见表 3、图2-1，图 2-2。表 3 两组实验小鼠治疗前后血脂比较（mg/dl）组别 N TC TG LDL-C HDL-C对照组 17 治疗前治疗后9.74 1.348.98 1.051.25 0.401.22 0.360.65 0.220.65 0.060.19 0.050.15 0.06给药组 20 治疗前治疗后9.41 1.828.69 2.521.20 0.340.91 0.13##**0.66 0.110.59 0.05#**0.18 0.070.15 0.08注：与同组治疗前比较#P<0.05，##P<0.01；与对照组治疗后比较**P<0.01。图 2-1 两组实验小鼠治疗前后 TG 比较注：与同组治疗前比较##P<0.01；与对照组治疗后比较**P<0.01。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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