当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞损伤的作用及相关机制研究

发布时间：2020-03-26 17:31

【摘要】：目的:本实验以集合管细胞(IMCD3细胞系)为研究对象,观察阿霉素诱导IMCD3细胞损伤后细胞凋亡、AQP2蛋白表达的变化;进一步探讨当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3损伤后cAMP、PKA、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表达的变化,初步探讨当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞损伤的作用机制研究。方法:第一部分不同浓度阿霉素对IMCD3细胞诱导损伤的研究1.MTT法检测不同浓度阿霉素对IMCD3细胞损伤的研究。观察不同浓度阿霉素作用下,IMCD3细胞生长状态的影响。2.倒置显微镜观察,随着阿霉素浓度变化,IMCD3细胞形态学的变化。3.Annexin V/PI染色法观察阿霉素的梯度变化,观察IMCD3细胞凋亡情况。4.Western blot法检测随着阿霉素浓度变化,IMCD3细胞AQP2蛋白表达的影响。MTT法及Annexin V/PI染色分为正常组、1×10~-77 mol/L组、1×10~-88 mol/L组、1×10~(-9)mol/L组、1×10~(-10)mol/L组、1×10~-1111 mol/L组;Western blot法分为正常组、1×10~-88 mol/组、1×10~-99 mol/L组、1×10~(-10)mol/L组、1×10~-1111 mol/L组。第二部分不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表达的作用1.MTT法检测当归芍药散梯度对阿霉素损伤的IMCD3细胞的生长影响。2.Western blot法检测不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导损伤的IMCD3细胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表达。MTT法实验分为正常组、模型组、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL、6.4mg/mL、12.8mg/mL;Western blot法实验分组正常组、模型组、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL.第三部分当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞损伤机制的研究1.ELISA法检测不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞cAMP含量。2.Na~+-K~+-ATP酶测定盒检测当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞Na~+-K~+-ATP酶活性变化。3.Western blot法检测不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP蛋白表达的变化,探讨当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞损伤机制的研究。实验分为正常组、模型组(阿霉素组)、当归芍药散低剂量组(0.2mg/mL)、当归芍药散中剂量组(1.6mg/mL)、当归芍药散高剂量组(3.2mg/mL)、H-89抑制剂组。结果:第一部分不同浓度阿霉素对IMCD3细胞AQP2蛋白表达的影响1.MTT法检测随着阿霉素梯度稀释后IMCD3细胞生长状态的影响。结果显示,较正常组比较,阿霉素浓度在1×10~-77 mol/L以上,OD值下降,形态学观察可见不同剂量的阿霉素对细胞呈现不同程度的抑制以及死亡,有显著性差异(P0.01);当其浓度降低为1×10~-99 mol/L、1×10~(-10)mol/L、1×10~-1111 mol/L时,OD值增高(P0.01)。2.Annexin V/PI染色法检测结果显示,较正常组比较,阿霉素浓度为1×10~-88 mol/L、1×10~-99 mol/L、1×10~-1010 mol/L、1×10~-1111 mol/L时细胞凋亡率逐渐升高,差异具有显著性意义(P0.01)。3.Western blot法检测结果显示,相比于正常组,阿霉素浓度为1×10~-88 mol/L,AQP2蛋白表达显著下调(P0.01);阿霉素浓度为1×10~-1010 mol/L、1×10~-1111 mol/L时,AQP2蛋白表达呈现不同程度的升高(P0.01)。Annexin V/PI染色法检测结果显示,较正常组比较,阿霉素浓度为1×10~-88 mol/L、1×10~-99 mol/L、1×10~-1010 mol/L、1×10~(-11)mol/L时细胞凋亡率逐渐升高,差异具有显著性意义(P0.01)。阿霉素的最佳浓度在综合MTT法、Annexin V/PI染色法、Western blot法实验结果后定为1×10~(-8)mol/L作为诱导损伤IMCD3的浓度作为最佳浓度以用于后续实验。第二部分不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表达的作用1.MTT法检测不同浓度当归芍药散对阿霉素诱导IMCD3细胞结果显示,较正常组比较,模型组IMCD3细胞生长增殖无明显影响(P0.05);较模型组比较,0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml、3.2mg/ml浓度下对IMCD3细胞生长增殖无明显影响(P0.05),6.4mg/ml、12.8mg/ml对IMCD3细胞生长增殖具有不同程度的抑制作用,差异具有统计学意义。2.Western blot法检测结果显示,较正常组比较,模型组AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表达显著降低(P0.01),较模型组比较,随着当归芍药散浓度的提高,AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白的表达均显著升高,并呈现一定的浓度依赖性,其中在1.6mg/mL升高最为明显(p0.01)。综合MTT法、Western blot法实验结果,在后期实验中采用0.2mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL作为分别作为当归芍药散低、中、高剂量组用于实验。第三部分当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞损伤机制的研究1.Na~+-K~+-ATP酶活性检测法结果显示,较正常组比较,模型组Na~+-K~+-ATP酶活性明显降低(P0.01);较模型组比较,当归芍药散各剂量组均能提高Na~+-K~+-ATP酶活性,其中中剂量对Na~+-K~+-ATP酶活性的提高最为明显。H-89抑制剂组较模型组Na~+-K~+-ATP酶没有显著差异。2.ELISA法检测当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞cAMP结果显示,较空白对照组,模型组cAMP含量显著降低(P0.05);与模型组比较,当归芍药散各剂量cAMP含量组均有不同程度的提高,其中当归芍药散中剂量提高的最为明显,不同H-89抑制剂组较模型组比较cAMP显著降低(P0.05)。3.Western blot法检测当归芍药散对阿霉素诱导的IMCD3细胞PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表达水平,结果显示:较空白对照组,模型组PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表达均显著降低(P0.01);与模型组比较,当归芍药散各剂量组升高了PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表达,且呈现一定的剂量依赖性,H-89抑制剂组较模型组比较PKA、CREB、AQP2显著降低(P0.05),对Na~+-K~+-ATP酶蛋白表达没有显著性差异。结论:1.阿霉素能够细胞凋亡途径促使IMCD3细胞损伤,可抑制AQP2蛋白的表达。2.当归芍药散可提高阿霉素诱导的IMCD3细胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白的表达。当归芍药散能提高IMCD3细胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白的表达从而加强细胞水液平衡调节可能是通过激活cAMP/PKA信号传导通路实现的。
【图文】：

阿霉素,细胞增殖,毒性作用,细胞的

1×10-9mol/L 1×10-10mol/L 1×10-11mol/L图 1-1 不同浓度的阿霉素对 IMCD3 细胞增殖的影响Figure 1-1 Effects of different concentrations ofADR on proliferation of IMCD3 cells.2 MTT 法检测不同浓度的阿霉素对 IMCD3 细胞的毒性作用

阿霉素,细胞,单位,浓度

图 1-2 不同浓度的阿霉素对 IMCD3 细胞 OD 值的影响(浓度单位：moFigure 1-2 Effect of different concentrations ofADR on the OD of IMCD3 注：与正常组比较，，**P<0.01.3 不同浓度阿霉素对 IMCD3 细胞凋亡的影响
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【参考文献】