木犀草苷对人表皮干细胞增殖的影响及作用机制研究

发布时间：2020-03-26 16:18

【摘要】：表皮干细胞(epidermal stem cells,EpSCs)在表皮再生、皮肤稳态维持和创面修复过程中发挥重要作用。表皮干细胞具有自我更新能力和增殖潜能,是制备组织工程皮肤理想的种子细胞。寻找能促进表皮细胞增殖的化合物将有利于为皮肤组织的体外制备提供更多的种子细胞。文献报道木犀草苷(Luteolin-7-glucoside,L7G)能通过抗炎、抗氧化、抑制透明质酸酶和胶原酶活性促进皮肤伤口愈合。目的探讨L7G是否能促进人表皮干细胞增殖并阐明其作用机制。方法1.利用中性蛋白酶和胰蛋白酶依次消化人皮肤组织制备表皮细胞悬液,通过Ⅳ型胶原快速贴壁法分离表皮干细胞。通过免疫荧光染色及流式细胞仪检测表皮干细胞标志分子(CK19、β1整合素、α6整合素、CD71)以鉴定表皮干细胞。2.分别通过MTT、BrdU掺入实验和Ki67免疫荧光染色检测L7G对表皮干细胞增殖的影响。用碘化丙啶标记DNA后经流式细胞仪检测L7G对表皮干细胞细胞周期分布的影响。通过体外划痕愈合模型观察L7G对表皮干细胞迁移的影响。3.通过RT-PCR和Western blot检测干细胞增殖相关基因的表达。4.通过HE染色、免疫组化和免疫荧光染色表皮干细胞标志分子分别观察L7G对体外培养皮肤组织表皮层厚度以及表皮干细胞数量的影响。结果1.分离培养的人皮肤表皮干细胞在光镜下呈鹅卵石样。免疫荧光检测显示这些细胞中CK19及β1整合素阳性的细胞占90%以上;流式细胞仪检测结果表明α6整合素高表达/CD71低表达的细胞占92.87%,说明分离培养的细胞为表皮干细胞并且纯度较高,并满足实验要求。2.通过MTT实验发现0.1-1 μM的L7G能够浓度依赖性地促进表皮干细胞增殖。BrdU掺入实验和Ki67免疫荧光染色结果证实L7G能促进表皮干细胞增殖。细胞周期分析发现L7G孵育表皮干细胞细胞能降低G1期细胞百分比、升高S期细胞百分比。1 μM的L7G能显著促进表皮干细胞迁移及划痕愈合。3.机制研究发现L7G能显著诱导β-catenin,c-Myc以及细胞周期蛋白D1、A2、E1的表达;L7G通过β-catenin和c-Myc介导促进表皮干细胞增殖。4.用L7G体外孵育人皮肤组织能显著增加表皮层的厚度,并增加表皮基底层的α6整合素阳性和β1整合素阳性细胞的数量。此外,p63以及细胞增殖抗原在表皮层细胞的表达都显著增强。这些结果说明L7G对离体培养的表皮干细胞及皮肤组织中的表皮干细胞都有促增殖作用。结论L7G通过上调β-catenin,c-Myc和细胞周期蛋白D1,A2和E1的表达促进体外培养的皮肤表皮干细胞增殖。L7G能促进培养的人皮肤组织表皮干细胞增殖,增加表皮层厚度。
【图文】：

３．１．２人皮肤表皮干细胞鉴定逡逑取培养的第２代表皮干细胞，通过免疫荧光染色检测表皮干细胞标志分子（Ｊ１整合素和逡逑ＣＫ！９的表达。由图２可见，（３１整合素、ＣＫ１９呈阳性的细胞占９０％以上。逡逑Ｐ１邋Ｉｎｔｅｇｒｉｎ逦ＤＡＰＳ逦Ｍｅｒｇｅ逡逑■■■逡逑ＣＫ１９逦ＤＡＰＩ逦Ｍｅｒｇｅ逡逑图２，免疫荧光染色检测表皮干细胞ＰＩ整合素和ＣＫ１９表达（Ｘ邋１００，标尺为１００ｐｍ）逡逑

２１逡逑进一步通过流式细胞仪检测表皮干细胞标志分子整合素ａ６和ＣＤ７１在培养的第２代表逡逑皮干细胞的表达情况。由图３可见整合素ａ６高表达、同时ＣＤ７１低表达的细胞占９２．８７％。逡逑这些结果表明我们分离培养的表皮干细胞纯度较高，满足实验要求。逡逑１邋０＾１邋３１逦Ｂ２逡逑１０３１逡逑Ｔ—逡逑卜逡逑Ｑ邋２逡逑0邋１０２１逡逑：逦栜．逡逑１0１ｌ＾逦Ｍ邋＇■逦？逡逑９２．８７。／＜逡逑１０１邋１０２邋１０３邋１０４逡逑ａ６邋ｉｎｔｅｇｒｉｎ逡逑图３．流式细胞仪器检测表皮干细胞ｕ６整合素和ＣＤ７１表达逡逑３．邋２邋Ｌ７Ｇ促进表皮干细胞增殖和迁移逡逑首先通过ＭＴＴ法检测Ｌ７Ｇ对表皮干细胞增殖的影响，发现与对照组相比，０．１－２逡逑Ｌ７Ｇ在培养表皮干细胞２４邋ｈ后能够显著促进细胞增殖，在培养４８邋ｈ后促增殖作用更明显逡逑（图４八）。丨０＂的Ｌ７Ｇ处理表皮干细胞Ｉ？４邋ｄ，，细胞增殖与对照组相比均有显著差异（图４Ｂ）。逡逑这些结果表明Ｌ７Ｇ能浓度依赖性和时间依赖性的促进表皮干细胞增殖。然后进一步通过逡逑ＢｒｄＵ掺入实验证实ｌ邋｜ａＭ的Ｌ７Ｇ能够促进表皮干细胞的增殖（图４Ｃ）。免疫荧光染色检测逡逑细胞增殖的标志分子Ｋｉ６７，发现Ｉ卜ｉＭ的Ｌ７Ｇ孵育表皮干细胞２４邋ｈ能显著增加Ｋｉ６７阳性逡逑细胞数（图４Ｄ），也证实了邋Ｌ７Ｇ对表皮干细胞具有促增殖作用。细胞周期分析发现Ｌ７Ｇ逡逑处理表皮干细胞能显著降低Ｇｌ期细胞比例、升高Ｓ期细胞的比例（图４Ｅ），说明Ｌ７Ｇ通逡逑过促进Ｇｌ期向Ｓ期转换而促进表皮干细胞增殖。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2601668