基于miRNA及其相关信号通路调控研究川芎嗪抑制血小板活化的作用机制

发布时间：2020-03-27 08:07

【摘要】：目的:研究川弯嗪体内外干预对血小板活化的影响,并从microRNA(miRNA)及其靶基因和相关信号转导通路调控探讨川芎嗪抑制血小板活化的作用机制,以期进一步从miRNA及相关通路调控丰富川芎嗪抗血小板活化作用机制,为其临床抗血小板治疗提供实验依据。方法:1、体外实验:血小板经不同浓度盐酸川芎嗪(Ligustrazine Hydrochloride,LH;1、2、3 mM)预处理后,给予二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP;5.5 μM)刺激,通过比浊法检测血小板聚集,流式细胞仪检测血小板内Ca2+含量,酶联免疫吸附试验(EnzymeLinked Immunosorbent Assay,ELISA)检测血栓素 B2(Thromboxane B2,TXB2)含量和Western-blot检测整合素αIIbβ3的表达及其磷酸化水平;体内实验:Sprague-Dawley(SD)大鼠经盐酸川号嗪预处理后(80mg/kg/d),通过皮下注射肾上腺素(Adrenaline;1mg/kg)构建血小板过度活化大鼠模型,采用剪尾法检测小鼠出血时间改变,并提取血小板和给予ADP刺激,采用比浊法检测血小板聚集,流式细胞仪检测血小板内Ca2+含量,ELISA检测血清中TXB2和6-酮-前列环素(6-keto-PGF1α)含量。2、采用Western-blot检测不同浓度盐酸川芎嗪(LH;1、2、3 mM)体外干预对ADP刺激后血小板中AKT、ERK、p38MAPK的表达及其磷酸化水平和80 mg/kg/d的川芎嗪体内干预对AKT表达及磷酸化水平的影响;采用AKT通路激活剂胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor 1,IGF-1;300 mM)诱导血小板,并通过比浊法检测血小板聚集,流式细胞仪检测血小板内Ca2+含量和ELISA检测血清中TXB2含量。3、采用miRNATLDA芯片检测川芎嗪干预对SD大鼠血小板中miRNA表达的影响,通过靶基因预测和通路(Pathway)分析川芎嗪干预后被显著富集的差异表达miRNA相关信号转导通路,并通过Western-blot检测AKT通路反向调节因子PTEN、THEM4和PHLPP等基因在蛋白水平的表达。结果:1、体外实验:川芎嗪体外干预显著抑制ADP诱导的血小板聚集,降低血小板中Ca2+含量和血小板上清液中TXB2的含量,降低血小板中整合素αIIbβ3的磷酸化水平;体内实验:川芎嗪预处理显著延长血小板过度活化SD模型大鼠出血时间,降低血小板Ca2+含量和血清中TXB2的含量,增加血清中6-keto-PGF1α含量。2、川号嗪干预显著抑制ADP诱导后血小板AKT、ERK和p38MAPK的磷酸化水平;川芎嗪干预显著降低AKT通路激活剂(IGF-1)诱导后的血小板AKT的磷酸化水平,显著抑制血小板聚集,降低血小板中Ca2+含量和血小板上清液中TXB2的含量。3、川芎嗪预处理显著下调血小板过度活化模型大鼠血小板中39个miRNA的表达,靶基因预测和Pathway分析证实PI3K/AKT通路被显著富集,川号嗪干预显著下调血小板miR-331-3p、miR-34a-5p及上调二者的共同靶基因、AKT反向调节因子PHLPP的表达。结论:川弯嗪体内外干预显著抑制血小板聚集,且通过下调miR-331-3p、miR-34a-5p等miRNA和上调PHLPP等靶基因表达,进而抑制PI3K/AKT等相关信号转导通路可能是其发挥抑制血小板活化的重要机制。
【图文】：

板聚集仪测定各组血小板的聚集率（Ｐｌａｔｅｌｅｔ邋ａｇｇｒｅｇｒａｔｉｏｎ邋Ｒａｔｅ），绘制血小板聚逡逑集曲线和计算最大聚集率（Ｍａｘ邋ｐｌａｔｅｌｅｔ邋ａｇｇｒｅｇｒａｔｉｏｎ）。实验结果如图１－１Ａ所不，逡逑对照组（Ｃｏｎｔｒｏｌ）中血小板聚集率一直维持在０左右，提示血小板未发生明显逡逑聚集；ＡＤＰ组的血小板聚集率经ＡＤＰ刺激后一直呈上升趋势，并在１５０邋ｓ后维逡逑持在相对稳定水平；而不同浓度的川芎嗪干预均发现具有不同程度降低血小板逡逑聚集的作用，且随着川芎嗪浓度的增高，血小板聚集率升高越缓慢。进一步计逡逑算血小板最大聚集率发现，与对照组相比（－２．９０Ｕ４．４７％），ＡＤＰ诱导可显著上逡逑升血小板的聚集率（６９．２５±７．４５％；邋Ｖ＜０．０５与对照组相比），而ｌ－３ｍＭ川芎嗪逡逑干预后血小板聚集率分别为６０．１２±１０．０８％、４７．８３±１１．０５％和１９．５４±２．１２％逡逑（＞＜０．０５，与ＡＤＰ组相比），即川芎嗪干预能够显著降低ＡＤＰ刺激血小板的逡逑最大聚集率。可见，川芎嗪干预具有显著抑制ＡＤＰ诱导的血小板体外聚集的作逡逑用。逡逑

小板中Ｃａ２＋含量的影响，本研究通过不同浓度川芎嗪预处理大鼠离体血小板，逡逑并给予ＡＤＰ刺激，采用流式细胞仪检测和分析血小板细胞内Ｃａ２＋的含量。实验逡逑结果如图１－２Ａ所示，与对照组相比，ＡＤＰ刺激后，代表血小板内Ｃａ２＋的含量逡逑的曲线明显右移，即ＡＤＰ刺激能够显著增加血小板内Ｃａ２＋的含量，而不同浓度逡逑川芎嗪干预后血小板内Ｃａ２＋的含量的曲线不同程度左移（与ＡＤＰ组相比），其逡逑中３邋ｍＭ的川芎嗪千预后Ｃａ２＋的含量的曲线左移最为明显。进一步的平均荧光逡逑强度分析发现分析如图１－２Ｂ所示，与对照组相比（１．９２±１．６０），ＡＤＰ干预能够逡逑显著增加血小板内Ｃａ２＋的含量（４０．０８±４．４３；邋＃Ｐ＜０．０５），而不同浓度川芎嗪干预逡逑后血小板内Ｃａ２＋的含量分别为３８．４４±６．８８、３０．７７士４．５７邋（＞＜０．０５，与ＡＤＰ组相逡逑比）和２４．１９±５．７９邋（＞＜０．０５，与ＡＤＰ组相比），均不同程度降低血小板内Ｃａ２＋逡逑含量。结果表明川芎嗪干预具有降低ＡＤＰ诱导的血小板中Ｃａ２＋含量的作用。逡逑Ａ邋§邋逦邋Ｂ逡逑－邋＃逡逑逦ＡＤＰ＋Ｉ邋１１（１邋ｍＭ）逦丁逦丁逡逑＾逦——ＡＤＰ＋Ｉ邋１１（２邋ｍＭ）逦＋４０－逦Ｉ逡逑ｉ邋Ｓ：，—、＂卜＾逦Ｈｉ邋ＢＨ邋Ｔ逡逑＾逡逑＾逦＿Xu＿W逡逑１＞逦＾逦１０２逦１６３逦１０＼ＤＰ（５．５ＵＭ）逦＿逦＋逦＋逦＋逦＋逡逑Ｆｌｕ0－４－Ｃａ邋２＋逦ＬＨ（ｍＭ）逦０逦０逦１２逦３逡逑图１－２川号嗪干预对ＡＤＰ诱导的血小板胞浆中Ｃａ２＋含量的影响。逡逑离体大鼠血小板经不同浓度川芎嗪处理后
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2602718