发酵黄芪多糖的结构表征及其对小鼠肠道黏膜免疫的改善作用

发布时间：2020-03-27 23:22

【摘要】：黄芪经非解乳糖链球菌FGM(分离于鸡盲肠内容物)发酵处理后,多糖的提取得率有显著提高,其促生长、修复肝损伤及调节小鼠骨髓源树突状细胞成熟的生物活性也有一定程度的改善,但发酵黄芪多糖(FAPS)对免疫抑制小鼠肠道黏膜免疫的调节作用还未见研究报道。本论文研究了 FGM菌株发酵黄芪后多糖的超声辅助提取工艺和结构表征,分析了发酵黄芪多糖对小鼠肠道黏膜免疫的保护作用,旨在为发酵提取的黄芪多糖进一步开发应用提供理论支持。1.为更高效地利用发酵黄芪提取多糖,采用超声辅助提取法,利用单因素试验、Box-Behnken及Design-Expert软件设计实验,通过响应面法分析得到关于发酵黄芪粗多糖(CFAPS)得率的提取时间、液料比和提取功率的模型方程,各因素对CFAPS得率的影响程度以液料比、提取时间和提取功率依次递减,其中液料比与功率交互作用最为显著。最佳工艺参数为提取温度50℃、提取时间60 min、液料比8 mL/g及提取功率480 W,得率为7.35±0.08%,高于传统的热水浸提法(6.95±0.24%)。结果表明,超声辅助提取法的应用能够在缩短提取时间的同时提高多糖得率。2.为探讨黄芪发酵后多糖的结构表征及抗氧化活性的变化,通过不同的化学方法检测,FAPS的总糖含量(86.34±1.19%)和硫酸基含量(1.36±0.05%)略高于黄芪多糖(APS)的总糖含量(77.33±2.60%)和硫酸基含量(1.19±0.03%),而FAPS的蛋白含量(6.38±0.62%)略低于APS(7.01±0.94%)。两者均无还原糖及酚类。通过高效液相色谱法(HPLC)检测,APS的主要单糖摩尔比为 Glc:Gal:Ara=27.92:5.20:2.86,而 FAPS 的主要单糖摩尔比为 Glc:Gal:Ara=23.45:2.50:3.16。通过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测,FAPS的平均分子量低于APS,尤其是在高分子量区段。通过红外光谱(FT-IR)、原子力显微镜(AFM)及刚果红实验检测,两者均含有吡喃糖和α-糖苷键,FAPS颗粒直径及高度均小于APS,且两者均不含三股螺旋结构。通过抗氧化活性实验检测,FAPS表现出更好的DPPH和羟基自由基清除能力。结果表明,黄芪发酵后多糖的结构表征无明显差异,而抗氧化活性的改善可能与平均分子量下降有关。3.为探讨FAPS对免疫抑制小鼠肠道黏膜免疫的调节作用,采用血常规、组织切片、ELISA、RT-PCR等方法检测,发现连续3d腹腔注射60mg/kg环磷酰胺(CY)可有效建立肠道黏膜免疫抑制模型,连续10 d灌胃400、600 mg/kg FAPS能够恢复体重、免疫器官指数、白细胞数量以及肠组织形态,调节SIgA a-chain和pIgR的基因表达量促进SIgA分泌,增加血清中IgA、IgG、IgM及IL-2、IFN-γ含量,恢复肠道的总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果表明,中、高剂量FAPS能够改善免疫抑制小鼠的肠道黏膜免疫功能。4.为探讨FAPS对免疫抑制小鼠肠道上皮屏障功能的影响,采用RT-PCR、Western blotting及组织免疫荧光检测,发现连续3d腹腔注射60 mg/kg CY能够显著降低小肠组织中紧密连接(TJ)和黏附连接(AJ)相关蛋白的表达,连续10 d灌胃400、600mg/k FAPS能够促进Ecadherin、Occludin、ZO-1、ZO-2、ZO-3、Cingulin 及 Claudin-2 的基因表达,同时能够促进 ZO-1、E-cadherin、Claudin-2及Claudin-7的蛋白表达。结果表明,中、高剂量FAPS具有保护和维持TJ/AJ蛋白表达量和完整性的作用,通过调节肠道上皮细胞屏障功能改善CY造成的肠道黏膜损伤。
【图文】：

Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｔｉｇｈｔ邋ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ邋（Ａ）邋（Ｆａｓａｎｏｅｔ邋ａｌ．，邋２００８）邋ａｎｄ邋ａｄｈｅｒｅｎ邋ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ邋（Ｂ）．逡逑紧密连接是由多种蛋白参与合成的并可与肌动蛋白环结构及功能性连接的蛋白质复合体，如逡逑图１．２Ａ所不。组成蛋白质复合体的蛋白主要有两种：一种为跨膜蛋白（Ｉｎｔｅｇｒａｌ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ），如逡逑闭封蛋白（Ｃｌａｕｄｉｎ）、闭合蛋白（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ）及连接黏附分子（Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ邋ａｄｈｅｓｉｏｎ邋ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ＪＡＭＳ）；逡逑另一种为外周膜蛋白（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ），又称细胞质斑块蛋白（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ邋ｐｌａｑｕｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ），逡逑如邋ＺＯ邋（Ｚｏｎｕｌａｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）家族、扣带蛋白（Ｃｉｎｇｕｌｉｎ）、Ｓｙｍｐｌｅｋｉｎ邋及邋７Ｈ６邋等（ＭｉｔｉｃａｎｄＡｎｄｅｒｓｏｎ，逡逑１９９８）。紧密连接的主要功能首先是封闭上皮细胞的间隙，形成一道与外界隔离的封闭带，保证组逡逑织内环境的稳定；其次是形成上皮细胞膜蛋白与膜脂分子侧向扩散的屏障，从而维持上皮细胞的逡逑极性（Ｃｉｔｉ邋ａｎｄ邋Ｃｏｒｄｅｎｏｎｓｉ，１９９８）0逡逑黏附连接是与肌动蛋白丝相连的锚定连接，如图１．２邋Ｂ所示，细胞与细胞之间的黏附连接称逡逑７逡逑

关于提取温度对ＣＦＡＰＳ得率的影响。在不同的温度水平（４０、５０、６０、７０和８０°Ｃ）下进行逡逑超声辅助提取，其余因素水平分别为：提取时间６０邋ｍｉｎ、液料比１５邋ｍＬ／ｇ及提取功率３６０邋Ｗ。如逡逑图２．１邋Ａ可知，粗多糖得率起初在４０邋°Ｃ至５０邋°Ｃ的条件下呈现小幅升高，随后出现降低并趋于平逡逑稳。因此，由提取温度的单因素试验结果可知，在５０邋°Ｃ条件下ＣＦＡＰＳ得率最高，因此选定５０邋°Ｃ逡逑为最佳的提取温度。逡逑关于提取时间对ＣＦＡＰＳ得率的影响。在不同的时间水平（２０、４０、６０、８０和１００邋ｍｉｎ）下进逡逑行超声辅助提取，其余因素水平分别为：提取温度５０邋°Ｃ、液料比１５邋ｍＬ／ｇ及提取功率３６０邋Ｗ。如逡逑图２．１邋Ｂ可知，粗多糖得率起初在２０邋ｍｉｎ至６０邋ｍｉｎ的条件下逐步升高，随后趋于平稳，而在１００逡逑ｍｉｎ时出现大幅下降。因此，，由提取时间单因素试验结果可知，在６０邋ｍｉｎ条件下ＣＦＡＰＳ得率最逡逑高，因此选定６０邋ｍｉｎ为最佳的提取时间。逡逑关于液料比对ＣＦＡＰＳ得率的影响。在不同的液料比水平（５、１０、１５、２０和２５邋ｍＬ／ｇ）下进逡逑行超声辅助提取，其余因素水平分别为：提取温度５０邋°Ｃ、提取时间６０邋ｍｉｎ及提取功率３６０邋Ｗ。逡逑如图２．１邋Ｃ可知，粗多糖得率起初在５邋ｍＬ／ｇ至１０邋ｍＬ／ｇ的条件下呈现小幅升高，随后逐步降低。逡逑因此
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2603540