四君子汤通过影响多胺以防治胃肠黏膜损伤的实验研究

发布时间：2020-03-27 22:49

【摘要】：多胺可促进胃肠黏膜损伤修复,还可调控紧密连接及粘附连接的形成和稳定而保护黏膜屏障功能。胃肠黏膜损伤是脾虚证常见的病理改变,四君子汤是益气健脾的代表方,临床常用于改善胃肠病患者脾气虚证。课题组前期研究表明,四君子汤水提物及党参、黄芪、甘草、白术的多糖提取物对应激性溃疡大鼠胃黏膜损伤有防治作用,机制与其提高胃或小肠黏膜多胺含量有关;对胃肠黏膜损伤修复环节——上皮细胞迁移的研究发现,党参、白术、黄芪、甘草、四君子汤的提取物(多糖、黄酮等)能促进小肠上皮IEC-6细胞迁移,作用与其影响多胺信号通路有关,Ca~(2+)调节是关键指标;白术多糖能提高IEC-6细胞粘附连接蛋白E-cadherin、β-catenin、α-catenin表达;但尚待在整体动物水平从细胞连接方面探讨益气健脾中药胃肠黏膜损伤修复作用机制。研究目的观察四君子汤(水提物和多糖)对吲哚美辛造模大鼠胃和小肠黏膜损伤的影响,并从多胺调节黏膜屏障和细胞连接蛋白的角度,探讨益气健脾代表方四君子汤防治胃肠黏膜损伤的作用机制。研究方法1、四君子汤水提物和多糖的提取分离:四君子汤药材(人参、炒白术、茯苓、炙甘草各等份)经水煎煮得四君子汤水提物,HPLC法进行成分分析;四君子汤经水提醇沉法、sevag法去蛋白,分别得“四君子汤多糖1”、“四君子汤多糖2”并以苯酚硫酸法检测糖含量,HPLC法检测“四君子汤多糖2”纯度。2、吲哚美辛致大鼠胃肠黏膜损伤模型的复制:大鼠皮下注射吲哚美辛(10mg/kg、40mg/kg)造模,7h后处死,筛选胃黏膜损伤造模的合适剂量;大鼠皮下注射吲哚美辛(4mg/kg、8mg/kg)造模,3d或7d后处死,筛选小肠黏膜损伤造模的合适剂量;以吲哚美辛6mg/kg+四君子汤水提物10g/kg,给药3d或7d,筛选四君子汤防治小肠黏膜损伤合适的给药时间。3、四君子汤防治大鼠胃和小肠黏膜损伤实验:(1)胃黏膜损伤实验:灌胃四君子汤水提物(5g/kg、15g/kg)1h后,吲哚美辛40mg/kg皮下注射造模,7h后处死动物,取材胃黏膜及血浆,记录各组胃黏膜损伤大体评分,HE染色进行病理评分;(2)小肠黏膜损伤实验:吲哚美辛6mg/kg/d皮下注射,造模共6d,每天再灌胃四君子汤水提物(5g/kg、15g/kg)或四君子汤多糖(0.358g/kg、1.074g/kg,与水提物生药量相当)共6d为给药方法,第7天处死动物,取材小肠黏膜及血浆,记录小肠黏膜损伤大体评分,HE染色进行病理评分。4、柱前衍生HPLC法检测胃、小肠黏膜多胺含量。5、试剂盒检测血浆D-乳酸浓度。6、ELISA法检测胃、小肠黏膜Ca~(2+)含量。7、Western blot和免疫组化法检测胃黏膜紧密连接蛋白(Occludin、ZO-1、Claudin-3)和粘附连接蛋白(E-cadherin、α-catenin、β-catenin)表达;免疫组化法检测小肠黏膜紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-3)和粘附连接蛋白(α-catenin、E-cadherin、β-catenin)表达。研究结果1、四君子汤提取物的纯化及分析:四君子汤水提物得率35.42%,为本研究受试药之一;高效液相色谱法可检测到甘草苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和白术内酯III等成分;四君子汤多糖1、多糖2得率分别为8.77%、7.16%,多糖含量分别为92.34%、81.59%;根据前期实验结果,多糖2药效较优,选为本研究受试药之一,高效液相色谱法分析发现“四君子汤多糖2”分子量较集中,是纯度较高的多糖,但存在其它较小的吸收峰,并非均一性多糖。2、吲哚美辛致大鼠胃和小肠黏膜损伤造模实验方案:(1)胃黏膜损伤模型:吲哚美辛(40mg/kg)皮下注射7h后,可造成大鼠胃黏膜损伤;吲哚美辛40mg/kg选为胃黏膜损伤造模剂量。(2)小肠黏膜损伤模型:吲哚美辛6mg/kg/d皮下注射,共6d,可造成大鼠小肠黏膜损伤;造模同时以四君子汤水提物(10g/kg)灌胃给药对小肠黏膜损伤有防治作用;吲哚美辛6mg/kg/d皮下注射,共6d(第7天处死),选为大鼠小肠黏膜损伤造模条件。3、四君子汤对吲哚美辛致大鼠胃和小肠黏膜损伤的影响:(1)四君子汤水提物(5g/kg、15g/kg)对造模大鼠胃黏膜损伤有防治作用;(2)四君子汤水提物(15g/kg)和多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)对造模大鼠小肠黏膜损伤有防治作用,大体和病理评分与模型组比较P0.05或P0.01,同等生药量下四君子汤多糖药效优于水提物。4、四君子汤对造模大鼠胃和小肠黏膜多胺含量的影响:(1)四君子汤水提物(5g/kg、15g/kg)可提高造模大鼠胃黏膜多胺(精脒)含量;(2)四君子汤水提物(15g/kg)、四君子汤多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)可提高造模大鼠小肠黏膜多胺(精脒)含量;提示四君子汤防治胃肠黏膜损伤作用可能与其提高多胺含量有关。5、四君子汤对造模大鼠肠通透性指标(血浆D-乳酸)的影响:(1)吲哚美辛致胃黏膜损伤实验发现,模型组大鼠血浆D-乳酸明显升高(与正常组比较P0.01),提示吲哚美辛造模可引起肠通透性增高,而四君子汤水提物(5g/kg、15g/kg)给药8h后,对造模大鼠血浆D-乳酸升高无明显影响。(2)吲哚美辛致小肠黏膜损伤实验发现,模型组大鼠血浆D-乳酸明显升高(与正常组比较P0.01);四君子汤水提物(15g/kg)和四君子汤多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)给药6d,可降低小肠黏膜损伤大鼠血浆D-乳酸(与模型组比较P0.05或P0.01),提示四君子汤可改善小肠黏膜损伤所致的肠通透性增高。6、四君子汤对造模大鼠胃和小肠黏膜Ca~(2+)含量的影响:(1)吲哚美辛致胃黏膜损伤实验发现,模型组大鼠胃黏膜Ca~(2+)含量降低(与正常组比较P0.05),提示胃黏膜损伤可引起Ca~(2+)含量降低;四君子汤水提物(5g/kg、15g/kg)给药8h后胃黏膜Ca~(2+)含量略高于模型组(P0.05)。(2)吲哚美辛致小肠黏膜损伤实验发现,模型组大鼠小肠黏膜Ca~(2+)含量略低于正常组(P0.05);四君子汤水提物(15g/kg)和四君子汤多糖(1.074g/kg)能提高小肠黏膜Ca~(2+)含量(与模型组比较P0.05);提示四君子汤一定程度上可提高造模大鼠小肠黏膜Ca~(2+)含量。7、四君子汤对造模大鼠胃和小肠黏膜紧密连接和粘附连接蛋白表达的影响:(1)吲哚美辛致胃黏膜损伤实验发现,四君子汤水提物(5g/kg、15g/kg)能提高造模大鼠胃黏膜紧密连接ZO-1、Occludin、Claudin-3和粘附连接E-Cadherin、α-catenin蛋白表达(与模型组比较P0.05或P0.01),但对β-catenin表达无明显影响;(2)吲哚美辛致小肠黏膜损伤实验发现,四君子汤水提物(15g/kg)和四君子汤多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)能提高造模大鼠小肠黏膜紧密连接ZO-1、Occludin、Claudin-3和粘附连接E-cadherin、α-catenin蛋白表达(与模型组比较P0.05或P0.01);四君子汤水提物(15g/kg)和四君子汤多糖(1.074g/kg)对β-catenin表达有提高作用(与模型组比较P0.05)。研究结论四君子汤(水提物和多糖)对吲哚美辛所致胃和小肠黏膜损伤有防治作用,可提高造模大鼠胃和小肠黏膜多胺(精脒)含量,提高胃和小肠黏膜紧密连接和粘附连接蛋白表达,对肠通透性指标增高和黏膜Ca~(2+)含量降低有改善作用,提示其防治胃肠黏膜损伤的作用可能与影响多胺和黏膜屏障有关;多糖是四君子汤胃肠黏膜保护的有效组分之一。研究结果为探讨益气健脾方药胃肠黏膜保护作用提供了参考。
【图文】：

吲哚美辛

吲哚美辛 40mg/kg 组图 2-1-1 吲哚美辛不同表 2-1-1 吲哚美辛不同剂正常组吲哚美辛 10mg/kg 组吲哚美辛 40mg/kg 组 2.2.1.3.2 吲哚美辛不同剂量对大鼠小如图 2-1-2、表 2-1-2 所示，正常组大常；吲哚美辛 10mg/kg 组大鼠小肠肠管未评分较正常组高；吲哚美辛 40mg/kg 组大损伤，大体评分与正常组无明显差异。

吲哚美辛,损伤图,大鼠

吲哚美辛 40mg/kg 组吲哚美辛 40mg/kg 组图 2-1-2 吲哚美辛不同剂量对大鼠小肠黏膜损伤图表 2-1-2 吲哚美辛不同剂量对大鼠小肠黏膜损伤的评分n 评分正常组 2 0吲哚美辛 10mg/kg 组 5 4.80 1.30吲哚美辛 40mg/kg 组 5 0.40 0.552.2.1.4 讨论本节以吲哚美辛（10mg/kg、40mg/kg）大鼠皮下注射造模，发现吲哚美辛（40mg/kg）能造成大鼠胃黏膜急性损伤，而对大鼠小肠未造成明显损伤，，与本实验室前期实验结果相似[38]，胃黏膜损伤模型复制成功，40mg/kg 选为后续胃黏膜损伤实验造模剂量；而吲哚美辛（10mg/kg）皮下注射则使大鼠小肠黏膜出现较明显损伤，结合文献报道[39]，较低剂量（如 10mg/kg）吲哚美辛皮下注射可能会引起大鼠小肠黏膜急性损伤，但本节实验大鼠样本量较少，待后续进一步探讨。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】