黄芪甲苷对2型糖尿病肾病大鼠内质网应激诱导的肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用

发布时间：2020-03-28 01:42

【摘要】：目的:研究内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激在高脂饮食联合低剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的2型糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠肾脏损伤中的作用,及研究黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)对其的影响。方法:通过高脂饮食饲养SD大鼠6周后,联合一次性腹腔注射(intraperitoneal injection,ip)低剂量STZ(35 mg/kg)制作DN大鼠模型。造模成功(血糖≥16.7 mmol/L)后,随机分为DN模型(Model)组,AS-Ⅳ(20,40,80 mg/kg)及二甲双胍(Metformin,200 mg/kg)治疗组,另设正常对照(Control)组,每组8只。以造模成功作为实验的起始,记为0周,连续给药8周。实验过程中观察各组大鼠一般状况,定期测定各组大鼠体重,血糖(blood glucose,BG)水平。实验结束时,代谢笼收集24h尿液,用于测定24h尿蛋白,尿微量白蛋白,尿肌酐(urine creatinnie,UCr)的含量;腹主动脉取血,用于测定血肌酐(serum creatinine,SCr),尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),甘油三酯(triglyeride,TG),总胆固醇(total cholesterol,TC)的含量。收集肾脏,称量其重量用于计算肾脏脏器指数;HE,PASM,Masson染色观察各组大鼠肾小管组织形态学变化;TUNEL染色及透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况;免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法检测各组大鼠肾小管上皮细胞GRP 78阳性细胞的表达情况;蛋白免疫印记(western blot,WB)法分别检测各组大鼠肾组织中Bax,Bcl-2,Cleaved caspase-3,p-PERK,ATF4,CHOP蛋白表达水平。结果:1.与正常组的大鼠相比,DN组的大鼠一般状况较差,出现精神萎靡倦怠,毛竖暗淡,身体消瘦,进食、进水,尿量明显增加;在经AS-Ⅳ治疗约3周后,大鼠一般状况便开始好转,“三多一少”的症状减轻。2.与正常组的大鼠相比,DN组的大鼠体重显著下降,而血糖水平显著升高(p0.001);与DN组相比,AS-Ⅳ治疗组,体重得到改善,但差异并不具有统计学意义(p0.05);血糖水平,在AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治疗6-8 W时,大鼠的血糖水平得到明显的改善,且差异均具有统计学意义(p0.01 or p0.05)。3.与正常组的大鼠相比,DN组的大鼠肾功能与代谢指标,肾重指数,尿微量白蛋白,尿总蛋白与尿肌酐之比值,SCr,BUN,TG,TC水平明显升高(p0.001);与DN组的大鼠比较,AS-Ⅳ(20,40,80 mg/kg)治疗组的大鼠,肾重指数得到改善,但差异并不具有统计学意义(p0.05),但其它肾功能与代谢指标得到明显改善(p0.001 or p0.01 or p0.05)。4.HE染色显示,DN组的大鼠近端肾小管出现严重的病理改变,如上皮细胞水肿、肥大、肾小管空泡病变、肾小管扩张、形态不规则、上皮细胞脱落等;AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治疗大鼠,肾小管病理变化得到明显改善,上皮细胞水肿、肾小管空泡病变减轻,上皮细胞脱落减少。PASM染色显示,DN大鼠近端肾小管基底膜染色明显增粗(黑色),表明基底膜增厚,与正常组比较,DN组PASM染色阳性评分明显增加(p0.001);AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治疗组的大鼠肾小管基底膜增厚减轻,与DN组比较,PASM染色阳性评分明显降低(p0.001 or p0.01)。Masson染色显示,DN大鼠近端肾小管基底膜及间质,蓝色区域明显增多,表明肾小管基底膜及间质具有较多的胶原沉积,与正常组比较,DN组Masson染色阳性评分明显增加(p0.001);AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治疗组的大鼠肾小管基底膜及间质胶原沉积减少,与DN组比较,Masson染色阳性评分明显降低(p0.001 or p0.01)。5.TUNEL染色显示,细胞核呈棕黄色的阳性细胞主要定位于近端肾小管内,与正常组相比,DN组的大鼠近端肾小管内可见大量凋亡细胞(p0.001);与DN组相比,AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治疗组的大鼠,肾小管内凋亡细胞明显减少(p0.001 or p0.01)。6.透射电子显微镜结果显示,与正常组相比,DN组的大鼠肾小管上皮细胞核表现为染色质固缩,核体积缩小,核膜收缩等凋亡形态结构特征;与模型组相比,AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治疗组的大鼠,肾小管上皮细胞核染色质、核膜等形态结构得到显著改善。7.免疫组织化学结果显示,与正常组比较,DN组的大鼠近端肾小管GRP 78蛋白阳性细胞数的表达水平明显增加(p0.01);与DN组比较,AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治疗组的大鼠肾小管GRP 78蛋白阳性细胞数的表达水平显著减少(p0.01 or p0.05)。8.WB结果显示,与正常组比较,DN组的大鼠肾组织凋亡相关指标Bax/Bcl-2,Cleaved caspase-3蛋白及ER应激相关指标p-PERK/PERK,ATF4,CHOP蛋白的表达明显增加(p0.01);与DN组比较,AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治疗组的大鼠肾组织上述蛋白的表达显著减少(p0.01 or p0.05)。结论:1.高脂饮食6周联合STZ 35 mg/kg成功制作糖尿病肾病大鼠模型。2.黄芪甲苷能够改善DN大鼠代谢指标及肾脏病理生理功能。3.黄芪甲苷能够减少凋亡相关指标Bax/Bcl-2,Cleaved caspase-3蛋白及内质网应激相关蛋白GRP 78,p-PERK/PERK,ATF4,CHOP的表达。4.黄芪甲苷可通过抑制内质网应激诱导的肾小管上皮细胞凋亡发挥肾脏保护作用。
【图文】：

药黄芪提取物中的主要活性成分，，一种皂苷类单分子量：784.97，化学结构见图 1。许多研究已以及抗凋亡等多种药理作用[28-29]。据报道，AS改变，延缓 DN 的发展，从而发挥肾脏保护作用实，AS-Ⅳ 对体外高糖培养的人肾小球系膜细胞保护作用[32-34]。 对 2 型 DN 肾小管上皮细胞凋亡的保护作用依高脂饮食联合小剂量 STZ 诱导 2 型 DN 大鼠模的肾小管上皮细胞凋亡的保护作用，以此为 AS方法。

N 组、AS-Ⅳ (20、40、80 mg/kg)组、二甲双胍组的大鼠在 STZ 注射 1况较差，表现为精神萎靡倦怠，毛竖暗淡，动作迟缓，弓背蜷卧，食、进水量，尿量明显增加；经 AS-Ⅳ 和二甲双胍治疗约 3 周后，开始好转，“三多一少”症状也有所缓解。芪甲苷对实验动物体重和血糖的影响黄芪甲苷对实验动物体重的影响验期间，于实验动物 STZ 注射后，每周同一时间定期，对各组大鼠后，进行统计学分析。如图 2 所示，与正常组的大鼠相比，STZ 糖大鼠体重减轻(p < 0.05)，且整个实验过程中，均低于正常组的大鼠(40，80 mg/kg)及二甲双胍治疗组的大鼠，与模型组的大鼠相比，体重复至造模前的水平，且差异并无统计学意义(p > 0.05)。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2603725