【摘要】：目的:以NLRP3炎症小体通路为切入点,以炎性细胞/组织-炎性细胞因子-信号转导为主线,评价桂枝抗炎有效部位对内毒素中毒小鼠的保护作用及抗炎效应的分子机制。方法:采用体外和体内实验相结合,评价桂枝挥发油和桂皮醛抗炎效应的NLRP3炎症小体通路分子机制。以THP-1巨噬样细胞为载体,采用不同的NLRP3炎症小体激活物造模,观察桂枝挥发油和桂皮醛对NLRP3炎症小体信号通路的影响。ELISA法测定细胞上清中ASC、Caspase-1(p20)、pro-IL-1β和IL-1β的含量,Western Blotting法检测细胞裂解液中NLRP3、ASC、ProCaspase-1和Pro-IL-1β蛋白表达,免疫荧光法测定Cathepsin B、NLRP3和ASC蛋白表达进行验证。RT-PCR法检测细胞裂解液中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达,荧光显微镜法测定细胞ROS含量。构建内毒素中毒C57BL/6J小鼠模型,观察桂枝挥发油及桂皮醛对小鼠一般状态和体重的影响,全自动血细胞计数仪测定全血WBC和PLT的计数,测定小鼠脏器指数,ELISA法和液相蛋白芯片技术测定血清中前炎症因子(IL-1β、IL-18、IL-5、IL-10、TNF-α和IFN-γ)和趋化因子(MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、M-CSF、GM-CSF和G-CSF)的含量,进行肺组织的病理组织学观察,Griess法测定肺组织NO含量,RT-PCR法测定肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、iNOS、p65、IFN-α、IFN-β和STAT1 mRNA的表达,Western Blotting法测定肺组织中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1,Caspase-1(p20)、Caspase-12、IL-1β、COP-1和POP-1蛋白表达,免疫组化法检测肺组织中P2X7R和Cathepsin B蛋白的表达。构建内毒素中毒KM种小鼠模型,评价桂枝乙酸乙酯部位及其主要成分桂皮酸对内毒素中毒小鼠的抗炎保护作用及机制。测定小鼠脏器指数和肺脏相对含水量,测定血清中BUN、CRE、ALT、AST及肝组织中SOD、MDA的水平,ELISA法测定血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IFN-γ的含量,进行肺脏、脾脏、肝脏和肾脏的病理组织学观察,RT-PCR法测定肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1βmRNA的表达,Western Blotting法测定肺组织中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1(p20)和Pro-IL-1β蛋白的表达。结果:以ATP和nigericin为NLRP3炎症小体激活物时,桂枝挥发油和桂皮醛能下调THP-1巨噬样细胞Pro-Caspase-1、p20、Pro-IL-1β和IL-1β蛋白及NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1βmRNA的表达。其中桂枝挥发油能显著降低细胞上清和裂解液中Pro-IL-1β蛋白表达(P0.05),抑制细胞裂解液中NLRP3和IL-1βmRNA的表达(P0.05)。桂皮醛能显著降低THP-1巨噬样细胞上清中Caspase-1(p20)水平(P0.05),抑制细胞裂解液中NLRP3、ASC和IL-1βmRNA的表达(P0.05)。此外,桂枝挥发油和桂皮醛能降低细胞NLRP3和ASC蛋白的相对共定位面积、细胞ROS及Cathepsin B蛋白的表达(P0.05)。给予桂枝挥发油和桂皮醛后,能改善内毒素中毒C57BL/6J小鼠的精神状态和活动情况。抑制血清中IL-1β、IL-18、IL-5、IFN-γ、MIP-1β和M-CSF的表达,减少肺组织中嗜中性粒细胞的数量和NO含量,下调肺组织中NLRP3、p20、Pro-IL-1β和P2X7R蛋白表达,下调肺中NLRP3、IL-1β、iNOS、IFN-βmRNA表达(P0.05)。此外,桂枝挥发油还能减少血清MCP-1的分泌和肺中STAT1 mRNA表达,桂皮醛能下调肺中Cathepsin B蛋白表达及升高COP-1蛋白水平(P0.05)。桂枝乙酸乙酯部位和桂皮酸能增加内毒素中毒小鼠的胸腺指数,减少模型小鼠血清中BUN、IL-18和TNF-α的含量,下调肺中NLRP3和p20蛋白及NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA的表达,并对脾和肺脏损伤有改善作用,对抗脾脏中淋巴细胞凋亡及减少肺中嗜中性粒细胞的数量。此外,桂枝乙酸乙酯部位能显著减少血清中CRE和肝脏中MDA含量,增加肝脏SOD活力和血清IFN-γ含量,显著下调Pro-IL-1β蛋白的表达。桂皮酸还能显著降低肺含水量和血清IL-1β水平(P0.05)。结论:桂枝挥发油、乙酸乙酯部位及桂皮醛、桂皮酸均可通过它们的抗炎活性,发挥对内毒素中毒小鼠的保护作用。抗炎机制与抑制NLRP3炎症小体信号通路激活相关。研究结果可为解表药桂枝治疗“表证”的临床运用提供了更为扎实的科学依据,并丰富了辛味解表药桂枝“辛散解表”性效理论的现代科学内涵。
【图文】：
桂枝挥发油的GC-MS总离子流图
成都中医药大学 2017届博士研究生学位论文.2 THP-1 细胞的生长曲线及细胞活力采用 MTS 法测定 THP-1 细胞在 72 h 内的生长情况发现，THP-1 细胞在~6 h 的生长存在一个停滞期，在 6 h~72 h 细胞处于对数生长期，表明可取培2 h 的细胞用于后续实验（见图 1-2）。此外，，经台盼蓝法测定细胞活力，结现所使用 THP-1细胞的活细胞率达 98%。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
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2603757
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