间充质干细胞联合白藜芦醇对1型糖尿病小鼠胰岛功能的保护作用

发布时间：2020-03-28 12:00

【摘要】：1型糖尿病(T1DM)的发病过程中,自身免疫的状态起着非常重要的作用。间充质干细胞(MSCs)在之前的研究中被证实能够有效的减轻自身免疫状况,给T1DM的治疗提供了新思路。目的:通过对初发T1DM的NOD小鼠应用脐带间充质干细胞(hUCMSCs)以及白藜芦醇的联合治疗来观察二者联合对T1DM小鼠治疗效果,探讨联合应用hUCMSCs与白藜芦醇对于减轻自身免疫状态,保护β细胞,改善胰岛功能的作用。方法:经检测成模的实验小鼠随机分为以下几组,并给与相应干预措施:(1)糖尿病对照组:于发病后不采用任何干预措施;(2)hUCMSCs组:于发病后第3天通过尾静脉注射hUCMSC 1×106/只;(3)白藜芦醇组:于发病后第三天起给与白藜芦醇200mg/kg·d灌胃;(4)联合治疗组:于发病后第3天通过尾静脉注射hUCMSC 1×106/只,同时给与白藜芦醇200mg/kg·d灌胃;(5)胰岛素组:于发病后给与甘精胰岛素治疗。(6)同时选取饲养9周后,未发病的NOD小鼠作为正常对照组。以发病当天记作第0天,分别于第7、14、21、28、35、42、49、56天称量体重并检测随机血糖。ELISA法测治疗前后空腹血清C肽。于发病56天处死小鼠,取血流式测定Th1/Th2细胞因子浓度,取脾脏流式测定CD4+CD5+Foxp3+T细胞(Treg)比例以及CD4+T细胞、CD8+T细胞比例,取胰腺制作冰冻切片,HE染色观察胰岛结构形态以及炎症细胞浸润情况。结果:1:一般情况观察各组小鼠在确诊糖尿病后,均出现饮水量、尿量增多的情况。糖尿病对照组较其他各组毛色晦暗且反应迟钝。2:体重变化情况糖尿病对照组体重出现较大幅度的、迅速的下降;而在联合治疗组以及白藜芦醇组小鼠体重在发病后并未出现过大波动;在单纯hUCMSCs治疗组,发病前期体重明显下降,而后出现体重恢复,在49d时已经恢复到发病时体重,并且与正常组小鼠体重相当。3:不同时点血糖变化情况hUCMSCs组、白藜芦醇组、联合治疗组在发病7d后血糖开始逐渐下降,与未治疗的糖尿病组相比存在明显的差异(P0.05)。hUCMSCs组、联合治疗组血糖控制效果明显,而且逐渐趋于正常组,14d后已经与正常组水平相当(P0.05),这种治疗效果一直持续到56d;联合治疗组以及白藜芦醇治疗组均能在早期实现应用少量胰岛素保持血糖的较低水平,而hUCMSCs组在21-28天胰岛素用量才开始下降。4:空腹血清C肽水平比较各组小鼠发病初期空腹血清C肽不存在显著差异(P0.05),经过相应治疗措施后,联合治疗组56d时空腹血清C肽较治疗前上升,且差异具有显著性(P0.05)。5:外周血清炎症细胞因子水平比较与糖尿病对照组相比较,联合治疗组、hUCMSCs组外周血清中IL-5,IL-6含量均显著升高(P0.05),IL-2,TNF-α,IFN-γ,IL-17水平显著下降(P0.05),应用白藜芦醇治疗组可以明显降低TNF-α,IFN-γ,IL-2,IL-17(P0.05),但对IL-5,IL-10效果不明显(P0.05)。6:治疗后脾脏淋巴细胞亚群以及Treg的比较hUCMSCs组、白藜芦醇组以及联合治疗组Treg均较糖尿病对照组有所升高(P0.05),但联合治疗组Treg升高的程度较其他各组存在着显著的差异(P0.05)。在56d糖尿病小鼠体内CD4+T细胞、CD8+T细胞均较正常组有显著的增加(P0.05),而各种治疗方式也都能够明显降低脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞水平,在hUCMSCs组、白藜芦醇组与联合治疗组之间CD4+T细胞、CD8+T细胞水平不存在显著差异(P0.05)。7:各组小鼠胰腺HE染色情况在正常对照组胰岛的结构完整,形态良好,未见炎症细胞浸润;胰岛素治疗组胰岛结构大量破坏,炎症细胞浸润明显;hUCMSCs治疗组胰岛的结构相对完整,形态良好,炎症细胞较少;白藜芦醇组胰岛的结构有一定损伤,细胞排列略紊乱,周围有炎症细胞浸润;联合治疗组胰岛形态相对较完整,炎症细胞浸润较轻;糖尿病对照组完整的胰岛结构在镜下基本找不到,大量炎症细胞浸润。结论:应用hUCMSCs联合白藜芦醇治疗方案可以明显改善患TIDM的NOD小鼠体重减轻的状态,改善体内高血糖的状态,升高小鼠空腹血清C肽水平。通过观察,我们认为白藜芦醇可以作为一种辅助药物,增加hUCMSCs的治疗效果,减轻β细胞损伤,维持残存β细胞功能。
【图文】：

间充质干细胞,脐带,表达率

结果1.hUCMSCs 分离培养，形态学观察从脐带组织分离出的hUCMSCs在接种3天后可见贴壁生长，光镜下细胞形态不一，多数呈梭形，含有部分圆形漂浮细胞，经换液后可去除。接种 8 天后观察到 hUCMSCs集落增多，形态较为一致，呈梭形。融合>90%后，消化传代培养，镜下可见 hUCMSCs呈形态均一的长梭形，多次传代保持稳定（图 1）。2.hUCMSCs 的鉴定P3代 hUCMSCs 经流式细胞仪鉴定细胞表面标记：CD105表达阳性，阳性率 99.3%；CD90 表达阳性，阳性率 96.3%；CD73 表达阳性，阳性率 96.7%；CD34 表达阴性，表达率 0.1%；CD45 表达阴性，表达率 0.1%；CD14 表达阴性，表达率 0.3%；HLA-DR表达阴性，表达率 0.1%（图 2）。hUCMSCs 高度表达间充质干细胞表面标记，不表达造血干细胞表面标记，符合国际上目前对 MSCs 的定义。

小鼠,体重,实验过程,糖尿

图 2 hUCMSCs 的流式细胞学鉴定动物的一般情况观察整个实验过程中，通过观察实验小鼠的饮食、尿量、皮毛、精神状态等，确诊糖尿病后，均出现饮水量、尿量增多的情况。达到观察终点时，糖尿鼠毛色相比较其他各组颜色更为晦暗，其中部分（7 只/10 只）出现脱毛情病对照组的小鼠出现反应迟钝，慵懒的情况。小鼠在实验过程中体重变化情况每只小鼠发病当天记作 0d（正常组以适应性饲养 1 周结束后记作 0d），分在第 7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d 体重值（表 4.1，表 4.2，图 4察我们可以看出在 T1DM 小鼠中，如果不采取治疗措施，体重会出现较大速的下降；而在联合治疗组以及白藜芦醇组小鼠体重在发病后并未出现过发病初期维持在相对稳定的状态；在单纯 hUCMSCs 治疗组，发病前期（<显下降，在 35d 时达到最低值，而后出现体重恢复，，在 49d 时已经恢复到
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】