青风藤碱抗炎作用及机制研究

发布时间：2020-03-28 11:19

【摘要】：从防己科千金藤属山乌龟亚属(Subgen.Tuberiphania Lo et M.Yang)植物中分离获得的异喹啉类生物碱(Isoquninoline alkaloids)青风藤碱(sinoacutine,sino),前期研究表明青风藤碱在小鼠耳廓肿胀、小鼠肉芽肿、大鼠胸膜炎和小鼠碳粒廓清等多种炎症与免疫抑制模型中均表现出较强的抗炎与免疫抑制活性,但尚待进行细胞分子水平研究,以确认其抗炎作用并探索作用机制,也待在炎性相关病症中进行抗炎活性研究。本文采用LPS刺激小鼠巨噬细胞建立体外炎症反应模型,从炎症因子PGE_2、COX-2、iNOS的表达及炎症主要通路NF-κB、MAPKs的活化来探讨青风藤碱在巨噬细胞中发挥的抗炎作用及其可能的分子机制。并通过建立LPS诱导小鼠急性肺损伤模型,检测青风藤碱对模型小鼠肺组织和肺泡灌洗液中细胞因子释放的影响,以期为青风藤碱后续更深入的研究开发及其在炎性疾病中的应用提供实验依据。研究内容具体如下:1.青风藤碱对LPS诱导RAW264.7细胞产生PGE_2的影响半数抑制率IC_(50)的测定:采用CCK-8试剂法考察青风藤碱对RAW264.7细胞的半数抑制率,经统计得到青风藤碱IC_(50)=144.487μg/ml。采用1μg/mlLPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症,以青藤碱(100μg/ml)和地塞米松(50μg/ml)作为阳性对照,青风藤碱以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml剂量预处理2h后与LPS共作用6h,提取细胞培养上清液,用ELISA方法检测炎症因子PGE_2,观察青风藤碱对PGE_2的影响。结果显示:青风藤碱高(100μg/ml)、低剂量(25μg/ml)能极显著抑制PGE_2的生成(P0.01),中剂量(50μg/ml)能显著抑制PGE_2的生成(P0.05)。提示青风藤碱是通过调节巨噬细胞产生PGE_2而发挥抗炎作用。2.青风藤碱对LPS诱导RAW264.7细胞活化后COX-2和iNOS表达的影响采用1μg/mlLPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症,以青藤碱(100μg/ml)和地塞米松(50μg/ml)作为阳性对照,青风藤碱以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml剂量预处理2h后与LPS共作用6h,分别提取细胞总RNA并逆转录成cDNA、提取细胞总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western免疫印迹实验分别检测青风藤碱COX-2、iNOS基因和蛋白表达的影响。结果显示:青风藤碱高(100μg/ml)、中剂量组(50μg/ml)能显著促进COX-2 mRNA的表达(P0.05);青风藤碱三个剂量组能极显著降低COX-2蛋白表达水平(P0.01),且具有良好的线性关系。青风藤碱低剂量组对iNOS mRNA有显著抑制作用(P0.05);青风藤碱三个剂量组亦能极显著降低iNOS蛋白表达水平(P0.01),具有良好的线性关系。提示青风藤碱可能是通过抑制iNOS和COX-2蛋白表达而发挥抗炎作用。根据中心法则,DNA、mRNA、蛋白质三者间趋势应保持一致,而研究发现基因与蛋白之间常出现非线性关系,便说明基因与蛋白结果会出现差异性,但因为蛋白质是最终的表现形式,因此以蛋白结果为主。3.青风藤碱对LPS激活RAW264.7细胞NF-κB信号转导通路的影响采用1μg/mlLPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症,以青藤碱(100μg/ml)和地塞米松(50μg/ml)作为阳性对照,青风藤碱以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml剂量预处理2h后与LPS共作用24h,提取细胞总蛋白,用Western免疫印迹实验分别检测青风藤碱对NF-κB信号转导通路中p65和IκB-α蛋白的影响,探讨青风藤碱在NF-κB信号通路中的作用机制。结果显示:青风藤碱三个剂量组均能极显著降低p65磷酸化水平(P0.01),且具有良好的线性关系。但青风藤碱对IκB-α的磷酸化水平无明显影响。提示青风藤碱可能是通过其他途径而绕过IκB-α蛋白来抑制NF-κB的活化。4.青风藤碱对LPS激活RAW264.7细胞MAPKs信号转导通路的影响采用1μg/mlLPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症,以青藤碱(100μg/ml)和地塞米松(50μg/ml)作为阳性对照,青风藤碱以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml剂量预处理2h后与LPS共作用24h,提取细胞总蛋白,用Western免疫印迹实验分别检测青风藤碱对MAPKs信号转导通路中ERK1/2,JNK和p38信号通路的影响,探讨青风藤碱在MAPKs信号通路中的作用机制。结果显示:青风藤碱高剂量组(100μg/ml)对ERK1/2磷酸化水平有降低趋势但无统计意义,中(50μg/ml)、低剂量组(25μg/ml)能显著促进ERK1/2磷酸化水平(P0.05)。青风藤碱三个剂量组均能极显著降低JNK磷酸化水平(P0.01),同时具有良好的线性关系。青风藤碱高剂量组(100μg/ml)能显著抑制p38磷酸化水平(P0.05),而低剂量组(25μg/ml)能显著促进p38磷酸化水平(P0.05)。提示青风藤碱可能对LPS诱导RAW264.7细胞存在免疫作用,具体作用机制尚不明确。5.青风藤碱对LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型的影响采用10mg/kg LPS建立小鼠急性肺损伤模型,12h后小鼠尾静脉注射给予青藤碱(13mg/kg)、地塞米松(7mg/kg)、青风藤碱高剂量(12mg/kg)、中剂量(6mg/kg)、低剂量(3mg/kg)、克班宁(5mg/kg),12h后处死,取肺进行肺系数计算、组织匀浆,ELISA法检测匀浆中细胞因子水平及MPO活性,另外进行肺部灌洗并用ELISA法检测细胞因子水平。结果显示:青风藤碱高、低剂量组能极显著减少肺系数,降低肺水肿程度(P0.01)。青风藤碱高(12mg/kg)、低剂量组(3mg/kg)能显著降低组织匀浆中NO的含量(P0.05),中剂量组(6mg/kg)有降低趋势但无显著抑制作用。青风藤碱三个剂量组均能显著抑制匀浆中MPO活力(P0.05),抑制中性粒细胞的聚集。青风藤碱中(6mg/kg)、低剂量组(3mg/kg)能极显著降低组织匀浆中TNF-α的含量(P0.01),高剂量组有降低趋势但无显著性。青风藤碱三个剂量组均能极显著抑制匀浆中IL-6(P0.01),且具有良好的线性关系。在肺泡灌洗液细胞因子检测中,青风藤碱中(6mg/kg)、低剂量组(3mg/kg)能显著降低TNF-α的含量(P0.05);青风藤碱三个剂量组均能极显著抑制IL-6(P0.01)。提示青风藤碱是通过抑制NO、MPO、TNF-α和IL-6的产生来发挥治疗小鼠急性肺损伤的作用。通过上述研究发现,在体外实验中,青风藤碱通过抑制iNOS和COX-2发挥抗炎作用,同时青风藤碱抑制NF-κB和JNK信号通路而达到抗炎效果;在体内实验中,青风藤碱抑制LPS诱导的肺部疾病和炎症从而发挥抗炎作用,使NO、MPO、TNF-α和IL-6的表达水平下降。以上结果为青风藤碱的研发提供了一定的实验数据和思路。
【图文】：

花生四烯酸代谢,急性肺损伤,肺水肿,药物作用

图 1 花生四烯酸代谢途径和主要代谢物的活性及药物作用环节igure 1Arachidonic acid metabolic pathway and activity of major metabolites and drug acti急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是由于感染、创伤等原因引起肺组织发生病理性改变的临床综合征，表现为肺水肿和肺不张。目前全球因肺损伤的死亡率高达 40%。内毒素介导的各种炎症介质和效应细胞常引起全身性损其是肺组织，肺是全身静脉血必经的巨型滤器，同时是一个开放的器官，肺各级支气管、气管与外界相通，因此肺很容易受到损伤从而引起肺部疾病[1S 主要通过活化肺泡中的巨噬细胞和中性粒细胞，引起促炎因子包括 TNF-6 的过度生成，这些因子又会趋化中性粒细胞等炎症细胞，引起细胞因子和因子的进一步释放[11]。一般采用机械通气的手段来进行治疗，，近年来虽有新疗策略，包括使用糖皮质激素，抗氧化剂，肺表面活性物质，血管扩张剂，酶抑制剂，免疫抑制剂等，但是仍然没有一个可行、有效的治疗方法使其降亡率[12]，而炎症反应是致肺组织损伤的首要因素，抑制炎性因子成为主要

非甾体抗炎药,炎症,药物,大类

因此采用抗炎药控制炎症是治疗 ALI 的重要措施，但有效的药物研究仍在探索中。图2 炎症中的细胞内信号通路Figure 2 Intracellular signaling pathway in inflammation目前用于炎症治疗的药物主要分为两大类：甾体抗炎药（steroiaanti-inflammatory drugs, SAIDs）和非甾体抗炎药（nonsteroia anti-inflammatorydrugs, NSAIDs）。甾体类抗炎药主要是类固醇类激素、肾上腺皮质激素等，如抗炎活性强的地塞米松[13-16]，对胸膜炎、出血性脑水肿、中耳炎等具有良好的抑制效果。但也存在严重不良反应，如水钠潴留，骨质疏松，免疫低下，感染等[17-26]。而以阿司匹林为代表的非甾体类抗炎药具有抗炎、抗风湿、止痛等作用，在临床上常用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、多种发热以及缓解各种疼痛症状，但长期服用也会对胃肠道、肾脏、心血管、肝脏、中枢神经系统等均造成一系列不良反应，如布洛芬、萘普生可致肾病综合征，长期服用阿司匹林会引起消化不良、胃膜糜烂等，长期或大剂量服用对乙酰氨基酚易导致肝坏死[27]
【学位授予单位】：云南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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