五味子木脂素组分治疗阿尔茨海默病的药效成分及作用机制研究

发布时间：2020-03-29 20:54

【摘要】：五味子中具有生物活性的木脂素组分是其具有神经保护作用和改善认知功能损伤的主要原因。但对五味子中木脂素组分治疗AD的药效成分及作用机制尚无系统且完整的研究。五味子木脂素组分在体内代谢过程的研究也主要集中在正常大鼠的药代动力学及代谢物的鉴定。目前尚无关于五味子木脂素组分在AD大鼠体内的代谢规律及药代动力学的研究,因此利用现代技术手段明确五味子木脂素组分治疗AD的药效成分及作用靶点,对揭示五味子治疗AD的作用机制研究是非常有意义的。本文对五味子中木脂素组分进行分离纯化及鉴定,并在此基础上,进行血浆代谢组学研究、入血成分及代谢物分析、网络药理学及药代动力学研究,以期全面深入的阐明五味子中木脂素组分治疗AD的药效物质基础及其作用机制,为新药开发提供有力的实验技术支持,同时为揭示中草药潜在的多化合物、多靶点、多途径的作用模式提供一种新的研究策略。本论文研究内容主要包括以下5个方面:1.五味子木脂素组分的分离纯化及鉴定利用正交试验以纯化后总木脂素提取率、得率及含量为指标,分别对传统溶剂热提法和闪式提取法的提取工艺进行优化,利用大孔树脂对提取液分别进行纯化。最终确定五味子木脂素组分的最佳提取纯化工艺为:闪式提取法提取,以体积分数为80%的乙醇为提取溶剂,料液比为1:19,提取电压100 V,提取时间为100 s,提取液浓缩后经大孔树脂纯化。而后根据相关文献建立五味子中木脂素类化合物的质谱数据库,利用液质联用技术,对纯化物中五味子木脂素组分进行了分析鉴定,初步鉴定出15种木脂素类化合物。2.Aβ25-35诱导AD大鼠的病理生理变化及血浆代谢组学研究AD的特点是进行性认知障碍,病理表现包括神经纤维缠结、淀粉样蛋白沉积和神经元丢失。目前阿尔茨海默病的发病机制尚不清楚,临床上也并没有有效的治疗药物。动物模型有助于了解疾病的发生和进展,并可用于开发潜在的药物。本文利用大鼠脑内海马CA1区注射Aβ25-35溶液建立AD模型。采用Morris水迷宫行为学实验、HE染色和免疫组化实验及血浆代谢组学方法,对所建立的AD大鼠模型病理生理及内源性代谢轮廓变化进行研究,结果表明,海马CA1区注射Aβ25-35对大鼠学习及记忆能力均造成了不可逆的损伤,这种损伤在4周内逐步加重,并在4周时达到顶峰,造模8周内均处于稳定的状态。在建模8周内,模型大鼠海马区Aβ蛋白不断沉积进而形成老年斑。随着Aβ不断的沉积,p-tau蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶和GSK-3β的含量也在建模8周内逐步提高,而脑内神经元的数量则呈现逐步减少的状态。同时AD大鼠体内神经递质功能发生紊乱,主要涉及GABA、Ach、Glu、5-HT、DA以及NE。通过对建模8周内不同时间点AD大鼠血浆代谢轮廓的研究,我们共鉴定出17个与AD相关的内源性代谢物,发现AD大鼠体内代谢紊乱主要涉及脂肪酸、鞘脂类、甾醇类代谢、维生素代谢和氨基酸代谢。3.五味子木脂素组分治疗阿尔茨海默病的血浆代谢组学研究本文通过Morris水迷宫行为学实验评估了五味子中木脂素组分对AD大鼠认知功能障碍的改善作用。结果显示,五味子木脂素组分能显著改善AD大鼠受损的空间学习记忆能力,且其作用效果与多奈哌齐没有显著差异。为阐明其作用机制,我们进一步研究了五味子木脂素组分对AD大鼠体内Aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经递质及内源性代谢物的调节作用,结果表明,五味子木脂素组分可减轻AD大鼠Aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化及神经元凋亡,并可通过上调GABA、Gly、5-HT和ACh含量,下调ACh E和Asp含量,缓解AD大鼠体内神经递质紊乱。通过血浆代谢组学分析,共鉴定出15个与五味子木脂素组分调节改善学习和记忆障碍有关的内源性代谢产物。这些生物标志物主要涉及鞘脂类代谢、亚油酸代谢及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。上述结果表明五味子木脂素组分能调节AD大鼠体内多个代谢通路,进而缓解神经炎症和氧化应激的神经毒性影响。4.五味子木脂素组分治疗阿尔茨海默病的药效成分及作用靶点关联分析AD与其它慢性疾病一样,均由多种基因或蛋白质的异常表达引起的。因此,针对单一靶点的药物很难有效治疗这些复杂疾病。本文对AD大鼠体内五味子木脂素组分可吸收入血的有效成分和代谢产物进行分析,共鉴定了10种木脂素入血原型成分和39种代谢物。分析结果得知其主要代谢反应途径包括羟基化、去甲基化、还原、磷酸化和脱水反应。在入血成分分析结果的基础上,采用靶向药理学方法,共筛选出17个靶点为五味子木脂素组分入血原型成分和AD的共同作用靶点,包括ACh E、i NOS、GSK3β和HMOX1等。对这些靶点进一步分析,发现这17个目标靶点还与AD相关的其它靶点具有相互作用,这些靶点被选为五味子木脂素组分治疗AD的潜在作用靶点,主要包括APP代谢、神经递质及炎症反应等。为了进一步揭示五味子木脂素组分减轻AD大鼠记忆和认知功能损害的药理作用机制,我们通过酶联免疫检测及UPLC-QQQ-MS技术进行了独立的验证性实验,研究结果发现,五味子木脂素组分对AD大鼠的APP代谢、NFTs、神经递质代谢、炎症反应和抗氧化系统均有一定的调节作用。5.五味子木脂素组分在AD大鼠体内的药代动力学研究联合应用UPLC-Q-TOF-MS和UPLC-QQQ-MS技术建立了一种快速、灵敏、可靠的分析方法,可同时测定血液样品中五味子木脂素组分的含量。利用该方法研究AD病理及健康状态下10种木脂素类化合物的药动学特点,分别得到正常大鼠和AD大鼠体内这10种木脂素类化合物的药-时曲线及相应的动力学参数。结果显示,与正常大鼠相比,AD大鼠对10种木脂素类化合物的吸收显著增加。表明在AD病理状态下木脂素类化合物的药代动力学规律发生了的改变,也可能是其发挥治疗作用的原因之一。上述研究结果为五味子木脂素组分用于治疗AD的相关药理或毒理学研究提供了可靠的实验数据,也为阐明五味子治疗AD的药效物质基础和作用机制奠定了理论基础。
【图文】：

五味子,木脂素,总离子流,正离子

五味子纯化物中木脂素组分正离子模式下总离子流图

离子色谱,五味子醇甲,五味子,串联质谱

五味子纯化物中五味子醇甲（a）及标准品（b）的提取离子色谱及串联质谱图
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285.5

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