中药复方茵陈五苓散的代谢组学研究

发布时间：2020-04-07 18:23

【摘要】：中药在我国拥有悠久的历史,其理论体系来自于中医学的辨证论治,代谢组学是在基因组学之后发展起来的新型学科,用于揭示生命活动现象和本质。中药现代化发展给代谢组学技术的发展带来了契机,使得代谢组学在中医药领域获得空前发展。中药复方茵陈五苓散由六味药组成,茵陈、泽泻、白术、猪苓、茯苓、桂枝,来源为东汉末年医学家张仲景的《金匮要略》,全方主治:“黄疸(伤寒或伏暑发黄、酒积黄疸、阴黄),小便不利,湿热烦渴。”杨时泰《本草述钩元》卷9:“燥黄、湿热为阳黄。又有阴黄。均以茵陈为君药。根据寒热症状配以不同的佐药。(海藏)茵陈五苓散。治疗一切黄疸。”方中以清利湿热的茵陈为君药,配合泽泻、猪苓、茯苓利水渗湿,白术健脾燥湿,桂枝辛温通阳化气行水。诸药合用,共奏清热解毒利湿、健脾和胃化浊之功。茵陈五苓散配伍较为复杂,多成分相互协同构成了其效应物质基础。目前对茵陈五苓散的研究较少,尤其对茵陈五苓散的治疗机制的探索方面尚不十分明确。本文旨在探究茵陈五苓散干预三种疾病的代谢通路分析,采用气相色谱与质谱联用(GC/MS)技术、液相色谱与质谱联用(HPLC/MS)技术,利用线性回归等分析方法,寻找潜在的差异性代谢物,采用标准品验证其结构,构建代谢网络图谱,从潜在差异性代谢物变化趋势揭示茵陈五苓散对黄疸型肝损伤、高脂血症、动脉粥样硬化作用机制的影响。具体研究结果如下:一、基于代谢组学技术研究茵陈五苓散水煎液抗黄疸型肝损伤机制为探索茵陈五苓散在治疗黄疸型肝损伤中对生物体内的调节作用。本研究以α-萘异硫氰酸酯灌胃大鼠,造成黄疸型肝损伤模型,模拟黄疸型肝损伤患者的病理状态,造模后对大鼠肝脏进行病理切片,发现模型组较正常组肝脏表面被大量炎细胞浸润,动物行为学显示大鼠全身发黄。再采用GC/MS技术测定实验组与正常组大鼠血清内物质的变化,将采集到数据导入XCMS在线软件进行谱峰校准,校准后的结果导入SIMCA-P12.0进行主成分分析(PCA)及叠加最小偏二乘判别分析(SPLS-DA),筛选出14个潜在差异性代谢物分别为:缬氨酸、甘氨酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸、肌醇、亚油酸、硬脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油酸、苹果酸、花生四烯酸、胆固醇,通过MetPA进行代谢通路富集,代谢网络构建结果显示,与茵陈五苓散治疗机制相关的3条主要代谢通路:花生四烯酸与亚油酸代谢通路、乙醛酸和二羧酸代谢通路、丝氨酸/丝氨酸/苏氨基酸代谢通路。二、基于代谢组学技术研究茵陈五苓散抗高脂血症作用机制为进一步了解茵陈五苓散对高脂血症大鼠代谢物的影响,探索茵陈五苓散治疗高脂血症的代谢通路。本研究给予大鼠高脂饲料模拟人体高血脂症模型,病理切片显示模型组肝脏表面布满脂肪泡,生化试剂盒检测造模后血清中总胆固醇和甘油三酯含量,发现模型组较正常组这两项指标显著升高(p0.05),药理学指标显示造模成功。将采集的血清采用GC/MS联用技术分析,尿液采用HPLC/MS联用技术分析。再将液质与气质提取的数据上传到XCMS在线软件对谱峰进行基线校正,峰识别,峰对齐等,并导入SIMCA-P12.0软件和Metaboanalyst软件进行PCA与OPLS-DA化学计量学分析,经多元统计学分析处理,从血清和尿液中一共筛选出16个与高脂血症相关的潜在差异代谢表达物,分别为丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸、焦谷氨酸、谷氨酸、延胡索酸、牛磺酸、甜菜碱、左旋肉碱、柠檬酸、草酰琥珀酸、磷酸羟基丙酮酸、三磷酸甘油、半乳糖醛酸、苯乙酰甘氨酸。将代谢物进行网络富集,发现与茵陈五苓散调节最密切相关的5条代谢通路分别为D-谷氨酸与D-谷氨酸盐代谢,丝氨酸/苏氨酸/甘氨酸代谢,牛黄酸和亚牛黄酸代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,丙氨酸/天门冬氨酸/谷氨酸代谢。三、基于代谢组学技术研究茵陈五苓散抗动脉粥样硬化的作用机制为进一步分析茵陈五苓散干预动脉粥样硬化的代谢通路,本实验采用维生素D3注射液、掺有维生素D3粉剂的高脂饲料复合造模,造成动脉粥样硬化大鼠模型,模拟人体动脉粥样硬化病症。对造模后的血清进行生化指标检测,发现模型组较正常组体内总胆固醇和甘油三脂含量显著升高(P0.001),病理切片显示模型组较正常组表面布满脂肪滴与脂肪泡,主动脉弓伴有粥样沉淀。药理指标初步显示模型成功,对SD大鼠的血清和尿液分别进行气质与液质分析,将分析的结果导入SIMCA-P12.0软件进行PCA、PLS-DA、OPLS-DA进一步降维分析,筛出15个潜在差异性代谢物:甘油、甘氨酸、丝氨酸、肌醇、柠檬酸、亚油酸、血肌酐、胆固醇、尿肌酐、酪氨酸、3-羟基丁酸、苯丙氨酸、马尿酸、半乳糖醛酸、苯乙酰甘氨酸,经过MetPA富集后,共找到与茵陈五苓散调控动脉粥样硬化最密切的5条代谢通路:亚油酸代谢、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸的生物合成、丝氨酸/苏氨酸/甘氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、甘油酯代谢。研究表明中药复方茵陈五苓散参与的疾病调节机制涵盖了多条代谢通路,干预三种疾病的共有通路:乙醛酸与而羧酸代谢通路、亚油酸代谢通路、丝氨酸/苏氨酸/甘氨酸代谢通路。茵陈五苓散平衡能量代谢、抑制炎症因子、清除自由基水平治疗疾病。本实验利用代谢组学技术研究茵陈五苓散对抗疾病模型的代谢通路,并识别和分析这些代谢通路,为临床上合理使用茵陈五苓散提供理论依据。
【图文】：

病理形态,肝损伤,HE染色,肝细胞

2.4 结果2.4.1 一般观察灌服 ANIT 橄榄油溶液 48h 内，无死亡现象。正常组大鼠饮食饮水正常，毛色光泽，，尿色清亮。高剂量实验组与阳性组较正常组无明显改变。模型组大鼠厌食厌水、毛发散乱无光泽，尿液呈黄绿色。2.4.2 YCL 对黄疸型肝损伤大鼠肝脏 HE 染色病理形态改变的作用光镜下可见：正常组大鼠的肝细胞排列十分整齐，结构比较清晰，肝细胞的肝索与肝窦间仅少量炎症细胞浸润；采用 ANIT 造模后，模型组大鼠肝细胞发生病变，肝细胞排列较紊乱，肝索肝窦间、中央静脉周见大量炎细胞散在浸润，肝细胞肿胀，肝细胞呈明显损伤状态。造模成功。给予茵陈五苓散干预后，茵陈五苓散高剂量实验组相比于其它组，炎症症状减轻明显，肝索肝窦间炎细胞少量浸润，肝细胞肿胀明显减轻。经过茵陈五苓散干预后，疾病有较好的恢复情况。

谱图,血清,色谱图,代谢物

广东药科大学硕士研究生学位论文2.4.3 经 GC/MS 分析得肝损伤大鼠血清代谢物丰度变化大鼠血清样本 GC/MS 分析总离子流（TIC）图见图（2-2）所示，在相同保留时间下，模型组与正常组丰度有明显差异，小分子物质的含量、种类、数目差异较大，相同时间处物质总含量差异明显，进一步推测模型组与正常组血清中小分子存在差异。在提取质量控制样品（QC）的 TIC 谱图，谱图分析结果：代谢物保留时间的相对标准偏差（RSD）<2%；离子丰度值的 RSD＜10%，在整个采集数据进程中气相色谱与质谱联用仪系统稳定，得到的数据可信[76]。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】