基于肝司生殖探讨母鼠孕前肝郁对雄性子鼠海马BDNF和NMDA受体影响及柴胡疏肝散的作用机理

发布时间：2020-04-07 19:18

【摘要】：研究背景和目的中医理论认为“肾主生殖”,然而实验和临床研究表明“肝司生殖”也得到了广泛的认同。肝主疏泄,使精气得以疏泄,肝藏血,使血量得以调节。根据“精血同源”理论,肝血充足,则生殖之精得以转化;肝主疏泄,能调畅气血和协调冲任,遂男子精壮,女子经调,而后方能子;而且肝经绕阴器,对生殖有直接的联系,故而有“肝司生殖”之说。实验研究表明母体在妊娠前、妊娠期间、分娩后各个阶段承受的应激均不利于子代的神经系统发育,并有可能在一定程度上造成子代的行为异常。查阅国内外文献发现之前关于产前应激对子代的实验研究大多侧重于妊娠后应激对子代的影响,而对于孕前应激对子代的影响却少有研究。肝郁证常模型采用慢性束缚应激方法,所以研究孕前肝郁对于子代神经发育情况的影响意义重大。因此,基于“肝司生殖”,本课题通过慢性束缚应激复制出肝郁母鼠,然后与正常雄性大鼠交配,将孕育出的子代大鼠作为研究对象,研究母体孕前肝郁对于子代雄性大鼠海马神经元形态和数目的变化,分析其机制是否与孕前肝郁对子代雄性大鼠海马中脑源性神经营养因子(Brain-Derived neurotrophic factor,BDNF)和谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)2A和2B受体表达的异常有关,并于造模后对母鼠采用柴胡疏肝散干预以了解其对子代雄鼠海马中BDNF、NR_(2 A)和N R_(2 B)的表达是否有影响。本课题是继研究肝郁对于生殖机能影响之后,对存活21天的雄性子代鼠海马BDNF,NMDA受体表达及海马神经元情况的进一步研究,为优生优育提供科学依据和新思路。研究方法:雌性Wistar大鼠18只,体重240±20g,鼠龄10-11周;在excel表格中随机分为正常组,模型组和柴胡疏肝散组,每组6只。雄性Wistar大鼠9只,体重220±20g,鼠龄10-11周。适应性喂养5天后,采用慢性束缚应激方法复制肝郁证雌性大鼠模型。雄性Wistar大鼠9只正常喂养,暂不予分组。分别在实验的第0、7、14、21天观察大鼠宏观表征,称量大鼠体重,在实验的第21天用高架十字迷宫实验记录行为学。慢性束缚应激造模21天及评价模型成功后完成后,雌鼠与雄鼠按照2:1的比例合笼饲养,每天8:00检查雌鼠的阴道分泌物涂片,以显微镜下能观查到精栓作为受孕的标志,将已妊娠的雌鼠进行单笼饲养直至其分娩。出生后21天,雄性子代鼠分别按照其母体的分组分为模型子代组,正常子代组和中药复方(柴胡疏肝散)干预子代组(简称“中药子代组”)。通过免疫组织化学法检测雄性子代大鼠海马组织中BDNF、NR_(2A)与NR_(2B)蛋白的表达情况;通过q RT-PCR法检测雄性子代大鼠海马中BDNF、NR_(2A)与NR_(2B) m RNA的表达情况;通过用HE染色法观察各组雄性子代大鼠海马中神经元细胞形态和数目的异常变化。结果1.孕前肝郁母鼠的造模和评价3周后,与正常组母鼠相比较,模型组母鼠表现为皮毛枯黄且无光泽,精神萎靡和倦怠,静卧少动躲藏在角落,眼角存在异常分泌物,耳廓的颜色变淡,饮水和进食均减少,粪便多稀溏,肝郁症状明显。而柴胡疏肝散组母鼠的状态优于模型组,接近于正常组母鼠的外观和表现。2.免疫组化结果与雄性正常子代对照组相比较,模型子代组雄性大鼠海马CA_3区BDNF蛋白的表达降低(P0.0 1),NR_(2 B)受体的表达降低(P0.0 1),均有显著的统计学差异,而NR_(2A)受体的表达虽有降低,但无统计学差异;与模型子代组雄性大鼠相比较,中药子代组雄性大鼠海马CA_3区NR_(2A)和NR_(2 B)受体的表达均有上升,且有统计学差异(P0.0 5),而BDNF蛋白的表达则无统计学差异。与正常子代组雄性大鼠相比较,模型子代组雄性大鼠的海马DG区BDNF和N R_(2 A)蛋白的表达均降低(P0.0 1),且均有显著的统计学差异,而NR_(2B)的表达虽也有降低但并无统计差异;与模型子代组雄性大鼠相比较,中药子代组雄性大鼠海马DG区NR_(2A)蛋白的表达升高(P0.01),NR_(2 B)受体蛋白的表达亦升高(P0.0 5),均有统计学差异,而B D N F的表达变化则无统计学意义。3.qRT-PCR实验结果与正常子代组雄性大鼠相比,模型子代组雄性大鼠海马中BDNF m RNA表达下调(P0.0 1),NR_(2 B )m R NA的表达下调(P0.0 5),NR_(2 A)的表达也有下调趋势,但是无统计学差异;与模型子代组雄性大鼠相比,中药子代组雄性大鼠海马中的BDNF m RNA表达上调(P0.01),NR_(2B )m RN A的表达亦上调(P0.0 5),NR_(2 A)的表达也有上调趋势,但是无统计学差异。4.HE染色结果与正常子代组雄性大鼠比较,模型子代组雄性大鼠海马CA_3区和DG区损伤的神经元数目增加,神经元突触的数量明显减少,神经细胞的排列亦紊乱而稀疏,出现明显的核固缩现象;与模型子代组雄性大鼠比较,中药子代组雄性大鼠海马CA_3区与DG区损伤的神经元数量和减少的突触数量并无明显差异。结论1 21天慢性束缚应激可以复制出较为理想的肝郁证母鼠模型,且柴胡疏肝散能缓解母鼠肝郁证的症状表现。2母鼠孕前肝郁可能会通过下调雄性子代大鼠海马CA_3区BDNF和NR_(2 B)受体蛋白的表达,下调雄性子代大鼠海马DG区B D N F和NR_(2 A)受体蛋白的表达,以及下调雄性子代大鼠海马中BDNF和NR_(2B) m RNA的表达,损伤海马神经元细胞,从而影响到雄性子鼠的学习记忆功能。3柴胡疏肝散对母鼠肝郁证有确切的疗效,其可能透过母体,通过逆转雄性子代大鼠海马CA_3区和DG区中NR_(2A)与NR_(2B)受体蛋白的表达或者BDNF与NR_(2B) m RNA的表达,而间接减缓母鼠孕前肝郁对雄性子代大鼠的影响。
【图文】：

子代,琼脂糖,大鼠,情况

电泳约 30分钟。5）曝光：在紫光灯观察下，采用凝胶成像系统拍照保存。（如图2-1）图 2-1 各组雄性子代大鼠 RNA 琼脂糖的凝胶成像情况(3)引物的合成与稀释：Rat-BDNF Forward primer5'-3'：gCCCAACgAAgAAAACCATAReverse primer5'-3'：CCTCCAgCAgAAAgAgCAgARat-NR2A Forward primer5'-3'：TgCCACAACgAgAAgAATgA,Reverse primer5'-3'：TgCTCCCAgATgAAggTgATRat-NR2A Forward primer5'-3'：AAAgCCCCATCATTCTCCTT,Reverse primer5'-3'：CACCAgACTCggCACAATC由生工生物工程（上海）股份合成，按照说明书每 OD 加入适量的无 RNA 酶水，配置成 100μM 的贮存液。（4）cDNA的合成：

体质量,双侧,次数

22图3-1 各组母鼠实验前后的体质量的比较3.1.3 各组母鼠的高架十字迷宫行为测试结果（1）母鼠于双侧开放臂与封闭臂的进入次数实验结果表明，与正常组母鼠比较，模型组母鼠双侧开放臂的进入次数减少(P＜0.01)，其进入双侧封闭臂的次数亦减少，但无统计学差异；与模型组母鼠相比较，中药组母鼠双侧开放臂的进入次数增多(P＜0.01)，其进入双侧封闭臂的次数略有增多，但无统计学意义。表 3-2 各组母鼠双侧开放臂和封闭臂分别进入的次数（ x±s）组别 N 双侧封闭臂进入次数双侧开放臂进入次数正常组 6 5.99±3.71 4.01±1.63模型组 6 4.28±1.57 1.15±1.08**中药组 6 4.55±3.42 3.97±2.29▲▲注：与正常对照组比较，* *P＜ 0.01；与模型组比较，▲ ▲P＜ 0
【学位授予单位】：河南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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