广藿香醇抗炎症性肠病的代谢组学和肠道菌群分析研究

发布时间：2020-04-08 18:02

【摘要】：目的:炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因不明的慢性复发性肠道炎性疾病,包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)两种亚型,临床主要表现为腹泻、腹痛、粘液便血。IBD发病机制尚不明确,近来有研究表明色氨酸(Tryptophan,Try)向犬尿氨酸(Kynurenine,Kyn)分解代谢加速,限速酶吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)表达增高、犬尿氨酸含量增加可抑制体内免疫对异体抗原的应答,与IBD的发生密切相关。色氨酸是内源性的自由基清除剂和抗氧化剂,能够对抗氧化性损伤并发挥抗炎作用;而犬尿氨酸类代谢物则具有免疫抑制作用,能诱导多种免疫细胞凋亡并削弱其分泌功能。此外,IBD可在一些具有致病潜力的肠道共生菌参与下,损伤肠屏障功能,最终引起自身免疫性炎症反应。因此,基于色氨酸代谢通路和肠道菌群两个角度,进一步了解IBD的病机,对寻求治疗IBD的有效药物具有重要的指导意义。广藿香是治疗暑湿蕴结诱发的胃肠疾患的岭南道地药材,具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑的功效。现代研究发现,广藿香及其主要有效成分——广藿香油、广藿香酮均具有抗IBD活性。而广藿香醇(Patchouli Alcohol,PA)是广藿香药材和广藿香油的指标性成分,具有抗炎、抗胃溃疡和免疫调节等多种生物活性。因此,我们推测广藿香醇可能具有抗IBD活性,并且本文拟基于色氨酸代谢通路和肠道菌群分析两个角度,寻找IBD发病相关内源性代谢标志物,观察DSS诱导IBD小鼠粪便结构组成及丰度,帮助我们进一步了解IBD的病机,深入对广藿香药效物质基础的认识。方法:研究采用3%DSS水溶液自由饮用建立实验性IBD模型,正常组(Control)给予等量自来水。造模当天开始,Control组及DSS组给予等体积药物溶剂,其余各组动物连续7天灌胃给予相应药物:广藿香醇(PA,10、20、40 mg/kg)或柳氮磺胺吡啶(SASP,200 mg/kg)。实验过程中,每天记录体重并观察粪便性状、便血情况,进行疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)综合评分。实验第8天,剖取各组小鼠肛门至盲肠段结肠,记录各组小鼠结肠长度。结合DAI和结肠长度,评价广藿香醇治疗IBD的疗效。收集血浆,进行除蛋白处理、冻干、定容,随后进行UPLC-MS测定;采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)对Control组、DSS组和各给药组进行模式识别;基于UPLC-MS测定结果搜索代谢组质谱数据库,筛选跟DSS诱导IBD小鼠模型相关的内源性代谢物,对色氨酸代谢通路进行靶向分析,同时运用蛋白免疫印迹技术检测通路相关限速酶(IDO-1和TPH-1)的表达,最后运用分子对接技术体外模拟广藿香醇与IDO-1蛋白活性位点的结合。收集肠道内容物,提取总DNA,应用454焦磷酸测序分析平台对得到的所有序列进行测序,进行物种分类、丰度分析、OTU韦恩图、物种进化分析、聚类分析等,观察组间差异,研究广藿香醇对肠道微生物多样性和种群结构等方面的影响。成果:本文研究发现,在3%DSS诱导的IBD模型中,广藿香醇各给药组显著降低小鼠DAI评分,恢复结肠长度。在血浆代谢轮廓分析中利用OPLS-DA分析方法进行数据预处理和造模,结果显示:各组样本分别聚集分布于不同的象限,提示DSS组与Control组样本、DSS组与各给药组有显著的区别;结合UPLC-MS测定结果和代谢组质谱数据库,最终筛选出19种潜在的内源性差异代谢产物,证明IBD的发生与氨基酸代谢、脂肪酸代谢、色氨酸代谢通路、谷胱甘肽、三羧酸循环和胆酸代谢息等息相关;同时我们鉴定出7种代谢物,用于区分正常动物和IBD模型动。其中,色氨酸代谢通路变化最为显著,对通路上下游代谢产物Try、Kyn、5-HT、5-HTP靶向分析结果表明:广藿香醇各给药组的Try含量明显升高,Kyn以及5-HT含量显著下降;蛋白免疫印迹结果表明:广藿香醇各给药组显著降低色氨酸代谢通路中重要限速酶IDO-1和TPH-1的表达;分子对接实验结果表明:广藿香醇与IDO-1蛋白活性位点结合从而抑制IDO-1过高表达。肠道菌群特定种属数量分析结果表明广藿香醇显著抑制致病菌(例如变形菌、脱硫弧菌、幽门螺旋杆菌)的生长;然而显著促进优势菌(例如拟杆菌、乳酸杆菌)的生长。结论:广藿香醇具有较好的抗IBD活性,为治疗IBD的潜在先导化合物。其作用机制可能是通过抑制相关限速酶的表达减缓色氨酸代谢速度,从而缓解IBD;同时调节肠内微生物组成和结构,保护肠道菌群微生态并保证其稳定。
【图文】：

广州中医药大学 2018 届硕士学位论文功能紊乱，升高 CD4+/CD8+比值，增表达[24]；对LPS诱导的急性肺损伤性[30, 31]；对人胃上皮细胞幽门螺旋疗作用[32]；通过抑制巨噬细胞浸润、吲哚美辛所致胃溃疡以及应激性氧化应激的具有调节作用[35]。前期BD 作用，可显著减轻 DSS 诱导 I 大鼠模型也有一定的治疗作用。

在粪便性状和血便状态方面（图 2B-C），DSS 组小鼠从第 3 天开始逐渐出现较为严重的稀便、血便，而广藿香醇能不同程度减轻小鼠的这些病理情况，小鼠大便为较软至湿软状，无明显血便出现。如图2D，，DSS组的DAI总评分明显高于Control组（P < 0.01），而广藿香醇则能显著降低 DSS 诱导 IBD 小鼠的 DAI 评分，且呈剂量依赖关系（P <0.05）。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2619658