香叶木苷诱导肝癌细胞HepG2坏死作用研究

发布时间：2020-04-09 04:14

【摘要】：香叶木苷又名地奥司明(Diosmin)是香叶木素(3',5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮)的苷元部分,在柑橘类水果、芸香科植物如两面针、茜草科药用植物如蓬子菜等天然植物中的含量丰富。近年来有报道,香叶木苷可抑制肿瘤细胞增殖,对癌细胞具有特异性促凋亡活性和化学预防作用,因而被认为是有潜质的抗肿瘤药物。本文将对香叶木苷对肿瘤细胞的增殖与凋亡等方面的机制作以研究。本研究的主要结果如下:(1)利用清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基及ABTS自由基法、亚铁离子螯合法和总还原力测定法对槲皮素、芦丁、橙皮苷和香叶木苷的体外抗氧化活性进行比较,验证了香叶木苷具有较强的抗氧化活性,其抗氧化能力与槲皮素、芦丁接近。(2)利用MTT法筛选香叶木苷对6种癌细胞系的增殖抑制作用,实验表明,香叶木苷对HepG2肝癌细胞的作用效果最明显,150μg/m L时开始有效果,200~400μg/m L作用效果显著且抑制率接近,因此选择200μg/m L为最佳浓度深入研究香叶木苷抑制HepG2肝癌细胞的作用机制。(3)对香叶木苷作用于HepG2肝癌细胞的机制的进一步研究得到以下结果:倒置显微镜直接观察发现作用3~5 h后细胞出现肿胀变形,7 h后出现小颗粒状物质,部分细胞呈碎块状,细胞数量明显减少,给药后出现枝状结晶;HE染色后观察发现3~5 h后胞内染色质聚集混乱,7 h后细胞膜被损坏,染色体断裂,细胞周围形成小泡,多数细胞呈碎裂状;利用流式细胞仪检测细胞周期分布,发现给药组处于G0/G1、G2/M期细胞的数量显著减少,S期细胞变化不明显,推测香叶木苷可能破坏G0/G1、G2/M期;利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,发现大部分细胞处于凋亡晚期或死亡区域内;利用DCFH-DA法测定给药后细胞内ROS的变化,发现给药后荧光强度明显增加,说明香叶木苷可诱导细胞内ROS的产生;荧光显微镜观察发现细胞由原来的多角形、菱形变圆,产生大小不一的圆形小颗粒,部分细胞局部出现破洞,随着作用时间延长细胞碎裂程度越高,推测香叶木苷可诱导HepG2肝癌细胞发生坏死作用。(4)探讨香叶木苷对HepG2肝癌细胞蛋白水平的影响,实验采用2-DE蛋白质双向电泳对细胞全蛋白进行表达差异的蛋白点进行筛选,在给药组凝胶上检测到976个蛋白点,空白组凝胶上检测到787个蛋白点,其中只在给药组中出现的蛋白点有265个,只在空白组中出现的蛋白点有2个,相对于空白组,给药组有42个蛋白点2倍上调。利用MALDI-TOF/TOF-MS质谱技术,对选取的7个差异蛋白点进行分析,并依据Gene Ontology、KEGG Pathway及String Network对其生物学功能进行下一步分析。最终推测香叶木苷对HepG2肝癌细胞的损伤作用的可能通路如下:与ACTA2相关的可能通过破坏细胞骨架结构,并调控Raf/MEK/ERK/Ca D通路与PI3K/Akt而起作用;与ENO2相关的可能与氨基酸的生物合成及糖代谢途径相关;与PKM相关可能与Ca信号通路和c AMP信号通路相关;与Hsp A8相关的可能为调控TGF-β/RTK/clathrin、MKK4/7/JNK/c-JUN/Jun D或JNK/MKP/PTP/p38及NF-κB通路;与AFP相关的可能为调控Hippo-YAP和Akt通路。因此推测香叶木苷对HepG2肝癌细胞的破坏作用可能是多途径共同参与的。
【图文】：

技术路线

图 3-7 槲皮素、芦丁、香叶木苷、橙皮苷结构Fig. 3-7 Structure of quercetin，rutin，diosmin and naringin研究发现黄酮化合物邻二酚羟基清除自由基能力强于间二酚羟基，其中 B环酚羟基活性高。自由基清除能力与其酚羟基位置的电子转移与脱氢能力有关。研究发现 TP 儿茶酚素的母核能与 5、7 位的两个羟基基团产生亲核作用，从而使 TP 作为优良的中子或氢供体，TP 可提供氢与自由基结合而被还原呈惰性化合物。如图 3-7 a) 槲皮素的抗氧化能力较强，因为 C 环上有 3-OH，B 环上有 4-OH，同时 C 环上 2，3 位双键和 4 位双键氧共轭，A，B 环之间的电子离域，同时在氢供给后，使得芳氧自由基更稳定。空间位阻的存在，，所以清除自由基能力有所降低。如图 3-7 c) 香叶木苷本身存在多个酚羟基，推其可向外提供氢离子，而破坏自由基链式反应从而发挥抗氧化作用。Fe2+可通过Fenton 反应使 H2O2解离生成 ROS，当香叶木苷存在时可与 Fe2+发生螯合，从而减少自由基的产生。抗氧化剂在清除自由基时，清除活性与抗氧化剂分子中有效酚羟基的数目和新形成的抗氧化剂自由基的稳定性有关。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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本文编号：2620279