【摘要】：目的:探究苦参素(matrine,MAT)对多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)的经典动物模型—实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠的神经功能学指征和脑组织病理学特征的影响,通过观察其中星形胶质细胞表面标志物—胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPG)的含量变化探究MAT对EAE大鼠脑中星形胶质细胞增殖情况的影响。同时,检测分析其中鞘氨醇(sphingosin,SPH),磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)和血浆凝溶胶蛋白(plasma gelsolin,pGSN)的含量变化,鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SPHK)的表达变化以及星形胶质细胞表面磷酸鞘氨醇1型受体(sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1P1)表达的变化情况,探究MAT抑制EAE大鼠脑中星形胶质细胞增生现象的作用机制,为临床探索治疗MS的方法提供实验和理论依据。方法:1.建立EAE大鼠模型:在冰浴和无菌条件下制备豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH),与等体积含卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)6mg/ml的完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)均匀混合,制成稳定的油包水(W/O)型抗原乳剂,四肢足垫皮下注射6~8周龄的雌性Wistar大鼠(0.5ml/只),建立GPSCH诱导的EAE大鼠模型。自免疫当天起,由两名实验人员每日独立进行实验动物神经功能学评分。2.动物分组及给药:采用随机数字表法,将30只免疫后大鼠分为三组:EAE模型组(EAE+Saline)-自免疫后第1天起每日腹腔注射生理盐水(6.7ml/kg);苦参素治疗组(EAE+MAT)-自免疫后第11天起每日注射用生理盐水稀释后的苦参素注射液6.7 ml/kg(250mg/kg)和苦参素预防组EAE+MAT-P(MATPretreatment)-自免疫后第1天起实施与苦参素治疗组等量的治疗措施。三组实验动物均干预至免疫后第17天。3.动物标本采集:免疫后第18天,将动物麻醉后,用生理盐水心脏灌注后留取大鼠脑组织并用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)冲洗。之后将右脑立即投入液氮中保存,左脑用4%多聚甲醛固定保存。4.相关指标检测:苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)和劳克坚牢蓝((Luxol fast blue,LFB)染色分别观察动物脑组织中炎性浸润和脱髓鞘的情况,免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)检测GFAP、CSPG的表达以及GFAP与S1P1的共表达,蛋白质印记法(western blot,WB)检测GFAP、pGSN的表达,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定SPH和S1P浓度,定量实时聚合酶链反应技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测SPHK1和SPHK2的mRNA表达。使用GraphPad Prism6.0软件对实验数据进行统计学分析。结果:1.神经功能学评分:统计分析结果显示,在EAE大鼠的发病高峰期(免疫后第18日),苦参素治疗组大鼠的神经功能学评分低于EAE模型组(P0.001),且预防组与治疗组大鼠的神经功能学评分也存在显著差异(P0.05)。2.脑组织病理学变化:与EAE模型组相较,苦参素对照组大鼠脑内炎性细胞浸润和脱髓鞘的情况明显缓解(P0.001,P0.01),苦参素预防组的情况又较于对照组发生明显缓解(P0.05,P0.01)。3.脑组织中星形胶质细胞增生情况的变化:western blot与免疫荧光染色结果显示,与苦参素治疗组相较,EAE模型组大鼠脑内的GFAP蛋白的表达量和荧光强度都明显更高(P0.001,P0.01),而苦参素预防组则较治疗组表达更低(P0.001,P0.01);与EAE模型组相较,苦参素治疗组大鼠脑内的CSPG的荧光强度亦表达显著降低(P0.01),而苦参素预防组则表现出更低的趋势(P0.05)。4.脑组织中S1P,SPH,pGSN的蛋白表达及SPHK1和SPHK2 mRNA的表达变化:ELISA结果显示,与EAE模型组相比,苦参素治疗组大鼠脑内S1P和SPH的含量均显著降低(P0.001,P0.001),苦参素预防组亦较治疗组显著降低(P0.001,P0.001);qRT-PCR结果表明,经苦参素治疗后,EAE模型组大鼠脑内SPHK1和SPHK2 mRNA的表达均明显减少(P0.05,P0.001);与苦参素治疗组相比,苦参素预防组大鼠脑内SPHK1 mRNA的表达量发生显著降低(P0.001),而两组的SPHK2 mRNA表达量则无显著差异。此外,用western blot检测脑组织内pGSN表达,结果显示与EAE模型组相比,苦参素治疗明显提升了大鼠脑内pGSN蛋白的表达量(P0.001),而苦参素预防组的pGSN蛋白量亦明显低于苦参素治疗组(P0.001)。5.脑内及星形胶质细胞上的S1P1的表达量:qRT-PCR结果显示,与EAE模型组比较,苦参素治疗组大鼠脑内S1P1 mRNA的表达量显著降低(P0.001),而苦参素预防组与之未表现出显著差异;与此对应,免疫荧光双染结果表明,与苦参素治疗组比较,EAE模型组大鼠脑内的星形胶质细胞表达更多的S1P1受体(P0.001),而苦参素预防组未表现出与模型组的统计学差异。结论:MAT对EAE大鼠有良好的治疗及预防效果,可以显著抑制EAE大鼠脑内的星形胶质细胞增生。MAT可以显著降低EAE大鼠脑内的S1P含量,是通过抑制SPH的产生和SPHK12的表达,上调pGSN,并且抑制S1P1在星形胶质细胞上的表达,从而起到对EAE大鼠病情的治疗及预防作用。
【图文】：
13图 1 MAT 改善 EAE 大鼠临床症状以及中枢神经系统炎症和髓鞘脱失情况采用豚鼠脊髓匀浆法诱导 Wistar 大鼠发生 EAE。大鼠于免疫后第 11 天和第 1 天分 治疗和预处理(250 mg/kg/日，腹腔注射)。EAE 模型组大鼠每日腹腔注射等量的生理照“材料和方法”一节所述评测神经功能评分的评分-时间曲线。(B) HE 染色和 LFB NS 炎症和髓鞘脱失(比例尺= 100μm)。(C) 炎症和脱髓鞘的平均评分。数据均用均数示，每组 n = 10。* P < 0.05，** P < 0.01，***P < 0.001。
14图 2 MAT 抑制 EAE 星形胶质细胞增生(A) (B) Western blot 检测大鼠脑组织中 GFAP 表达。(C) (D)免疫荧光染色检测脑组织中 GFAP表达。用 GFAP 单次免疫荧光染色(×200)检测三组星形胶质细胞(红色)特征以及 GFAP 表达的定量分析。 (E) (F)免疫荧光双染检测脑组织中 CSPG+(红色)与 GFAP+(绿色)共表达(×200)以及CSPG 表达的定量分析。所有数据均用均数±标准差表示，，每组 n = 10。* P < 0.05， ** P < 0.01，*** P < 0.001。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 刘光秀;王吉天;夏继云;宋喜峰;王朝霞;蒋晓玲;;苦参素注射液对恶性淋巴瘤化疗患者生化指标的影响[J];中外医疗;2011年20期
2 罗瑞,刘淑琴;苦参素注射液治疗湿疹的疗效观察[J];岭南皮肤性病科杂志;1999年02期
3 郑卫东;马晓军;吴剑华;康俊杰;;苦参素注射液抗乙肝病毒疗效及与中医证型关系的临床研究[J];中西医结合肝病杂志;2008年02期
4 肖倩;;苦参素注射液治疗HBeAg阴性慢性乙型肝炎的疗效及其与基因突变位点的关系[J];陕西中医;2006年01期
5 贺敦伟,尹莉芳,张陆勇,江振洲;苦参素注射液在犬体内的药动学过程[J];中国医院药学杂志;2005年08期
6 黄明龙,丁毅鹏;苦参素注射液治疗慢性乙型病毒性肝炎45例疗效观察[J];中国热带医学;2003年04期
7 高作文,张瑞祺,缪晓辉;苦参素注射液致慢性乙肝患者肝功能损害加重2例[J];药物不良反应杂志;2002年02期
8 沈志鸿,吴伊旋,毛维翰;苦参素注射液治疗各型湿疹[J];中国新药与临床杂志;2000年06期
9 袁瑗;李立安;刘艳新;王芳;刘阳;沈志娥;;复方苦参素注射液配合卵巢癌术后化疗的临床观察[J];中国医院用药评价与分析;2010年04期
10 杨静;;苦参素注射液治疗晚期消化道恶性肿瘤40例[J];陕西中医;2008年09期
相关会议论文 前10条
1 韦炜;;苦参素注射液对胆碱酯酶影响的临床分析[A];2006年浙江省感染病、肝病学术会议论文汇编[C];2006年
2 杨柏雄;;苦参素注射液配合中药治疗慢性乙型肝炎35例分析[A];中华中医药学会脾胃病分会第十八次学术交流会论文汇编[C];2006年
3 顾国清;;苦参素注射液治疗50例慢性肝炎疗效观察[A];全国第七届农村基层中西医结合学术暨工作交流会论文汇编集[C];2002年
4 巫娟;孟小斌;余永湘;;苦参素注射液治疗慢性乙型肝炎临床观察[A];2004年中华医院管理学会学术年会论文集[C];2004年
5 佘会元;邬祥惠;张觉民;冯正宗;;苦参素注射液对慢性乙型肝炎肝纤维化的治疗[A];第十三次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2004年
6 王维伟;宋乐冬;陈建杰;;树突状细胞表面分子的表达在苦参素注射液抗HBV中的作用[A];全国第4届中西医结合传染病学术会议论文汇编[C];2012年
7 徐兴江;;苦参素注射液治疗慢性乙肝42例的临床分析[A];第十三次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2004年
8 郜娜;乔海灵;;康艾注射液和苦参素注射液在大鼠体内的药代动力学[A];全国第十一届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2009年
9 李小华;;苦参素注射液联合白细胞介素-2治疗慢性乙型肝炎疗效观察[A];中华医学会第七次全国感染病学术会议论文汇编[C];2001年
10 张水源;;苦参素注射液联合复方丹参滴丸治疗慢性乙型肝炎临床研究[A];中医药现代化研究学术大会论文集[C];2001年
相关重要报纸文章 前3条
1 宁夏博尔泰力药业股份有限公司董事长 张军 周上栻;造思想文化声势立博尔泰力之业[N];科技日报;2005年
2 王 星;中医抗癌进行时[N];中国中医药报;2004年
3 国讯;被抽验产品总体质量良好[N];中国医药报;2011年
相关博士学位论文 前1条
1 高红宇;苦参素对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏间质纤维化的影响及机制研究[D];华中科技大学;2005年
相关硕士学位论文 前7条
1 马雯迪;苦参素抑制EAE大鼠脑中星形胶质细胞增生的机制研究[D];郑州大学;2019年
2 谭岁赛;热疗条件下苦参素注射液对胃癌SGC-7901/DDP细胞增殖及耐药性的作用研究[D];南华大学;2018年
3 冯巍巍;苦参素增强多柔比星对人肝癌耐药裸鼠移植瘤的抑制作用及相关机制研究[D];右江民族医学院;2018年
4 苏建伟;苦参素通过自噬调节结肠癌化疗耐药的实验研究[D];右江民族医学院;2018年
5 钟自强;苦参素通过抑制P-糖蛋白表达逆转结肠癌细胞的多药耐药性[D];右江民族医学院;2017年
6 张明亮;苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎大小鼠巨噬细胞免疫调节作用机制研究[D];郑州大学;2017年
7 毛卫;复方苦参素注射液联合TACE治疗原发性肝癌的系统评价[D];皖南医学院;2014年
本文编号：
2623015
