增液汤对津亏衰老便秘大鼠肠道菌群及宿主代谢影响研究

发布时间：2020-04-12 02:44

【摘要】：目的:增液汤作为我国的传统古方,目前在临床上广泛用于治疗津亏便秘以及其它慢性疾病。但是大多数关于增液汤的研究都是基于它的药理作用,仍然缺乏一种综合的、系统的研究去进一步揭示其发挥治疗效果的特定的作用途径或潜在的作用靶点。近些年来,人们开始意识到肠道菌群与肠道生理功能的关系,这提示了我们,增液汤发挥治疗作用的靶点也许与肠道菌群相关。因此,本论文从分子生物学、肠道微生态学和代谢组学的角度探究增液汤治疗便秘的靶点,更深入地阐明增液汤药效的本质,解释肠道微生态群落与宿主代谢组在便秘的发病机制以及增液汤的治疗过程中的作用。方法:(1)采用限水法叠加灌胃盐酸洛哌丁胺和皮下注射D-半乳糖的方法建立津亏便秘衰老模型。并通过宏观指标:体重、24小时排便量和进食量;生化指标:SOD值(超氧化物歧化酶)和MDA值(丙二醛);生理指标:小肠墨汁推进率、小肠含水率、结肠粘膜厚度、皮肤真皮层厚度;病理切片:结肠粘膜细胞状态、皮肤真皮层细胞状态,来评价造模效果。并在模型成功之后给予增液汤治疗,用上述指标来评价治疗效果。(2)在动物实验期间于不同时间点收集大鼠的粪便和尿样。其中,部分粪样被用来进行生物信息学分析,包括DGGE(变性梯度凝胶电泳)和16S RNA测序。另外一部分粪样和尿样则送去打核磁进行代谢组学分析。在分析代谢物时,我们先对核磁谱的峰进行归属。然后对所得积分数据进行多元统计分析,筛选与模型以及给药相关的差异代谢物,通过代谢通路分析,找到影响的生物相关代谢通路。解释对宿主代谢的调控作用。在肠道微生态学分析中,我们先利用PCR-DGGE(聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术)研究津亏衰老便秘大鼠以及增液汤干预后的肠道菌群指纹图谱,并探讨肠道菌群随时间变化趋势。再利用16S rDNA测序技术分析肠道菌群的结构与多样性。最后通过LEfSe分析和PICRUSt分析筛选津亏衰老便秘证模型大鼠肠道菌群生物标志物并预测其功能,最后利用宏基因测序去验证代谢功能。结果:(1)在造模结束后,模型组大鼠出现体重下降,食欲不振,排便量减少的情况,在解剖后我们发现模型组的大鼠小肠墨汁推进率、小肠含水率、结肠粘膜厚度和皮肤真皮层厚度均明显低于正常组,并且模型组大鼠的SOD值显著低于正常组而MDA值显著高于正常组。在药物干预后,上述指标均有不同程度的改善。(2)代谢组学结果显示:选取造模结束即第28天的数据进行解谱,共解出了105种内源性代谢物,其中尿样代谢物74个,粪样代谢物56个。经过多元统计学分析,我们进行模型验证,验证方法为排列验证(permutation test)和CV-ANOVA。实验证明造模第28天时,所有的模型参数均符合要求且和验证均通过。同样的,借助多变量统计分析方法,我们找出了尿样和粪样中的差异代谢物。其中尿样27个,粪样23个。在代谢通路分析中,我们发现造模后对宿主的影响,分别是:干扰了能量代谢;抑制了丁酸的合成;干扰了胆碱和甲烷的生物活性;扰乱了肝肾功能;干扰了体内氨基酸的代谢。在给予药物治疗后,药物干预导致了模型组中20个代谢物发生显著变化(尿样12,粪样9,共同1)。且这些代谢物的变化趋势与造模时期相反,影响的代谢通路主要为能量代谢,甲烷代谢,氨基酸代谢和细菌毒素代谢。(3)肠道微生态学结果显示:造模结束后,正常组与模型组的肠道菌群结构上有明显差异,并且该差异随着增液汤干预后逐渐减小。在生物多样性分析中,模型组的α-多样性最低并与正常组存在显著差异,而给药组与正常组接近无显著差异。同样的,模型组的β-多样性与正常组差别较大,而正常组与给药组差别较小。LEfSe分析中,与模型组相比较,给药组和正常组呈现较低水平的Helicobacteraceae,Desulfovibrionaceae(包括Desulfovibrio),Ruminococcaceae(包括Ruminococcus),Lactobacillaceae(包括Lactobacillus),Prevotellaceae(包括Prevotella)和Dorea,以及较高水平的Aeromonadaceae、Oxalobacteraceae(包括Oxalobacter)、Veillonellaceae、Clostridiaceae(包括Clostridium)和Roseburia。通过PICRUSt分析对生物标志群落进行功能预测,整个造模和给药过程影响显著的代谢功能有果糖和甘露糖代谢、甲烷代谢、赖氨酸生物合成、丙酮酸代谢、戊糖磷酸途径、细菌毒素、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解和谷氨酸代谢。结论:本研究成功的建立了SD大鼠的津亏便秘衰老模型。从代谢组学与肠道微生态学的角度去研究造模及药物干预对大鼠的影响作用,找出了主要发生改变并与疾病相关的代谢通路和肠道菌群。深入探讨了机体在不同状态下的肠道菌群组成分布、宿主粪便与尿液的代谢组学变化。阐明了在津亏衰老便秘时肠道菌群与宿主代谢的相互关系以及增液汤对模型大鼠的肠道菌群和代谢的调控作用,为便秘的治疗和增液汤的进一步开发提供有效的理论基础。
【图文】：

技术路线图,肠道菌群,疾病,药科大学

广东药科大学硕士研究生学位论文试疾病相关指标去评价造模和给药效果。利用 600MHz NMR 技术对尿样和粪样谢物的变化情况进行追踪监测，并寻找在造模和药物干预过程中的差异代谢物进代谢通路分析。同时，利用 PCR-DGGE 技术和 16S 高通量测序技术去对大鼠肠群的结构组成变化进行分析，鉴定出差异菌群并确定其具有的代谢功能，并结合组学信息对肠道菌群的代谢功能与宿主的代谢通路之间的相关性进行整合。本研在从微生态学的角度初步探讨增液汤影响肠道菌群结构治疗便秘的机制，为临床液汤的治疗作用以及便秘的防治补充理论基础，，也为人类研究疾病与治疗药物之相互作用关系提供新的思路和方法。本文研究思路及技术线路图如下（图 1-1）：

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模型组造模 5 周后，分为恢复组（n = 10）和给药组（n = 10），给药组给予增液汤进行干预 4 周，给药浓度为 63 mg/mL，给药体积为 10 mL/kg。恢复组与正常组进行对照处理。所有组均自由进食、饮水。2.2.2 增液汤配制在 30 g 玄参，24 g 地黄，24 g 麦冬加入 8 倍量的水，浸泡 4 小时，煮沸 1 小时，第一次过滤，滤渣再加入 6 倍量的水重新煮沸 1 小时，第二次过滤。合并两次滤液，浓缩至每 1 mL 溶液含 1 g 生药量。2.2.3 样品收集分别于造模前 1 天，造模第 21 天、第 35 天、第 49 天以及第 63 天，收集大鼠的尿液、粪便。并在第 35 天和第 63 天收集血样。收集完后对尿样和血样进行离心处理，然后取其上清液进行分装后保存于-80℃冰箱超低温冰箱，避免反复冻融。收集完最后一次尿液和粪便后，大鼠在当天晚上 8 点至次日早上 8 点禁食，次日处死大鼠，收集颈背部皮肤、小肠、结肠待后续分析。具体实验与采样流程见图 2-1。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】